maFGF对慢性衰老大鼠脑组织中ATP酶活力的影响

maFGF对慢性衰老大鼠脑组织中ATP酶活力的影响

黄俊杰¹⁾ 王彩冰¹⁾ 赵善民¹⁾ 何显教¹⁾ 黄丽娟¹⁾ 黄彦峰¹⁾ 梁祚仁¹⁾ 李倩茗²⁾ 黄巨恩²⁾

1)右江民族医学院应用生理研究室百色5330002)广西医科大学南宁530021

广西教育厅科研项目：200707LX136号

【摘要】目的观察改构型酸性成纤维细胞生长因子(maFGF)对D-半乳糖致衰老大鼠脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶活力及Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力的影响，探讨maFGF抗衰老的机制。方法选择成年Wistar大鼠40只，采用皮下注射D-半乳糖建立衰老模型，衰老模型成功后随机分为衰老对照组、NS对照组和maFGF治疗组。另10只不注射D-半乳糖作为正常对照组。maFGF治疗组按12 μg/kg剂量肌内注射，1次/d，共14 d，NS对照组肌肉注射与maFGF治疗组相同容量的生理盐水，1次/d；衰老对照组不作任何干预。各组大鼠到相对应的时间点取出各组大鼠脑组织，测定脑组织匀浆中Na⁺-K⁺-ATP酶活力及Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力。结果与正常对照组相比，衰老对照组大鼠脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶活力及Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力均明显著降低(P<0.01)；maFGF治疗组脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶活力和Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力均明显高于衰老对照组、NS对照组(P<0.05)。结论maFGF能升高衰老大鼠脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶活力及Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力，对衰老大鼠脑损伤有一定保护作用。

【关键词】改构型酸性成纤维细胞生长因子；D-半乳糖；慢性衰老模型；ATP酶活力

Effects of maFGF on the activities of Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATPase in cerebral cortex of subacute aging model rats

【Abstract】 ObjectiveTo study the effects of modified acidic fibroblast growth factor(maFGF) on the activities of Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATPase in cerebral cortex of subacute aging model rats.MethodsThe aging model rats were established by injection of D-galactose. Wistar rats were randomly divided into control group, model of aging group, normal saline (NS) and maFGF treatment group. The activities of Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATPase in cerebral cortex were detected.ResultsThe activities of Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATPase in cerebral cortex were significantly decreased than those in control group (P<0.01). After maFGF intervention, the activities of Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATPase in cerebral cortex of the maFGF group were significantly increased compared with the NS group and model of aging group respectively(P<0.05).ConclusionmaFGF can increase the activities of Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATPase in cerebral cortex in D-galactose induced subacute aging model rats.

2009年底，我国60岁以上的老年人口已经达到1.67亿，占全国总人口的12.5%，中国已经步入老龄社会。抗衰老的研究是现代医学研究的焦点和热点。目前的研究认为，人类的衰老与氧自由基的损伤有关，衰老的自由基学说已得到公认，该学说认为，由于诸多因素的作用，使体内产生过多的自由基，可对生物体内的蛋白质、核酸、脂质等产生抗氧化损伤，导致机体老化。maFGF是多功能生长因子，具有多种生物活性作用^[1]。本研究通过观察maFGF对D-半乳糖致衰老大鼠脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶活力及Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力的影响，探讨maFGF抗衰老的机制。

1.1动物衰老模型与分组取成年清洁级Wistar大鼠30只，由广西医科大学动物实验中心提供(动物合格证号：SCXK(桂)2009-0003),雌雄各半，体质量250 g左右。衰老模型每日皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，注射60 d后，大鼠行动迟缓，毛色松散无光泽，自发性活动减少，形体瘦弱，呈现明显的衰老体征，证明衰老模型成功建立^[2-3]。衰老模型模型建立成功的动物入选本实验。入选 30只Wistar大鼠随机抽签法分为衰老对照组、NS对照组和maFGF治疗组， maFGF治疗组皮下注射D-半乳糖的同时，1 h后按12 μg/kg剂量肌内注射，1次/d，共14 d,maFGF由广州暨南大学生物工程研究所提供；NS对照组皮下注射D-半乳糖的同时，1 h后肌内注射与maFGF治疗组相同容量的生理盐水，1次/d；衰老对照组只皮下注射D-半乳糖，不作任何干预。另外10只大鼠不注射D-半乳糖，作为正常对照组。各组动物饲养环境、条件均相同：分笼普通饲养，自由饮水摄食。室温26 ℃，湿度50%～60%饲养。各组大鼠到相对应的时间点分别迅速取出脑组织，用生理盐水洗去表面残血，准确称取组织重量，按重量体积比加9倍生理盐水制成10％的脑组织匀浆，1500 r/min离心10 min后取其上清液，再用生理盐水将上清液稀释成2%脑组织匀浆待测定。

1.2脑组织Na⁺-K⁺-ATP酶活力和Ca²⁺?-Mg²⁺?-ATP酶活力的测定Na⁺-K⁺-ATP酶活力及Ca²⁺?-Mg²⁺?-ATP酶活力的测定试剂盒说明书操作，测定仪器为UV755B紫外分光度计(上海分析仪器总厂)。规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位，即 (μmolPi/ mgprot /hour)。脑匀浆蛋白定量按采用考马斯亮蓝染色法测定。

1.3统计学分析采用SPSS 13.0软件对实验数据进行统计学处理，所有数据用(x±s)表示，组间比较采用t检验。

　　衰老对照组与正常对照组相比，脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶活力和Ca²⁺?-Mg²⁺?-ATP酶活力均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；NS对照组与衰老对照组相比，脑组织中Na⁺-K⁺-ATP酶活力和Ca²⁺?-Mg²⁺?-ATP酶活力差异均无统计学意义(P>0.05)；maFGF治疗组与衰老对照组和NS对照组相比，脑组织中 Na⁺-K⁺-ATP酶活力和Ca²⁺?-Mg²⁺?-ATP酶活力均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

　　2009年底，我国60岁以上的老年人口已经达到1.67亿，占全国总人口的12.5%，中国已经步入老龄社会。随着人口老龄化趋势的加快，抗衰老研究日益受到重视。目前的研究认为，人类的衰老与氧自由基的损伤有关^[4]，衰老的自由基学说已得到公认，该学说认为，由于诸多因素的作用，使体内产生过多的自由基，可对生物体内的蛋白质、核酸、脂质等产生抗氧化损伤，导致机体老化。ATP酶是存在于组织细胞及细胞器生物膜上的一种蛋白酶，其在物质运送、能量转换、信息传递以及维持细胞膜的完整、组织代谢等方面具有重要的意义，可作为代谢紊乱及损伤组织恢复能力的可靠指标。ATP酶是逆离子梯度进行细胞膜内外转运的离子泵，其中重要的为Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶。Na⁺-K⁺-ATP酶^[5]是位于细胞膜上的一种糖蛋白，是维持细胞正常的形态和功能等多方面有重要的意义，如果Na⁺-K⁺-ATP酶的活力下降细胞外大量Na⁺进入膜内，由于渗透压的关系，必然会导致过多水分进入膜内，引起细胞的肿胀，进而破坏细胞的结构。Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶^[6]也是一类广泛存在于细胞膜上的重要膜结合酶，它可以水解ATP，使细胞内Ca²⁺?泵到细胞外，以维持细胞内相对较低的Ca²⁺?浓度，这是维持细胞稳态的重要机制之一，也是细胞功能得以正常发挥的基础，Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力的降低可引起细胞的离子跨膜转运障碍及胞浆内Ca²⁺ 的积聚，导致细胞的形态、结构和功能的异常。ATP酶可作为代谢紊乱及损伤组织恢复能力的可靠指标。

研究发现，随着年龄增加，Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力下降,势必引起神经细胞内游离钙浓度增加，最终引起钙稳态的失调，细胞内钙超载，从而加速细胞的衰老^[7]。提高Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力能起到抗自由基和维持钙稳态的作用，故在一定程度上可以起到延缓衰老的作用。

　　aFGF为体内广泛分布的一种多功能生长因子，主要分布于脑、肝、肾、骨、软骨等组织，对中胚层及神经外胚层来源的细胞具有促有丝分裂作用^[8-9]。aFGF还存在广泛的非促分裂生物学活性,包括神经调节、舒张血管等。maFGF是切除了aFGF中诱导DNA合成和细胞增殖的氨基酸序列,利用DNA重组技术而获得的aFGF突变体,其不再具有促分裂活性，但仍能与FGF受体结合并诱导受体介导的酪氨酸磷酸化和c-fos的表达,使非促分裂活性得以保留^[10]。本实验研究结果表明，慢性衰老后大鼠脑组织的Na⁺-K⁺-ATP酶活力和Ca²⁺?-Mg²⁺?-ATP酶活力均显著低于正常对照组，说明慢性衰老后使大鼠脑细胞发生损伤。经过用maFGF治疗慢性衰老大鼠后脑组织的Na⁺-K⁺-ATP酶活力和Ca²⁺?-Mg²⁺?-ATP酶活力均明显升高。说明maFGF能促进维持细胞膜的稳定性和钙稳态状态，从而发挥延缓脑细胞衰老的作用。其主要机制可能为： maFGF能扩张血管，改善局部脑血流量，使脑血流量增多，减轻神经细胞缺血缺氧，减少的氧自由基生成^[11-12]，从而对神经细胞具有保护作用。

[1]曹定国,李校塑,付小兵,等.改构酸性成纤维细胞生长因子对小鼠胸腺细胞凋亡的影响[J].中国生物工程杂志,2003,23(9):80-83.

[2]何宏文,周丽华,袁群芳.衰老与海马CA1区锥体细胞退行性变及自由基和空间记忆的关系[J].中国临床康复，2003,7(22):3 044-3 045.

[3]陈树元,金伟军,陈志良,等.D-半乳糖致大鼠亚急性衰老模型的建立[J].第一军医大学学报,1995,15(3):233.

[4]Dei R,Takeda A,Niwa H,et al.Lipid peroxidation an dadvanced glycation end products in the brain in normal aging and in Alzheimer’s disease[J]. Acta Neuropathol，2002，104(2):113-122.

[5]文玉杰,李晓玫.钠钾ATP酶的信号转导功能新进展[J].生理科学进展,2005, 36(2):159-162.

[6]Barber D,Hunt J,Ehrich M. Inhibition of calcium-stimulated ATPase in the hen brain P2 synaptosomal fraction by organophosphorus esters: relevance to delayed neuropathy[J].J Toxicol Environ Health A，2001,63(2):101-113.

[8]吕文天,龚守良,李校堑,等.aFGF的生物学特性[J].中国生化药物杂志,2005,26(1):49-51.

[9]姚维成，孟庆海，赵英杰.成鼠骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化的实验研究[J].中国实用神经疾病杂志,2006,9(4):54-55.

[10]汪小凤,郑青,蔡绍晖,等.非促有丝分裂型人酸性成纤维细胞生长因子的受体结合特征及对MAPK信号通路的影响[J].中国药科大学学报,2005,36(2):179-182.

[11]Jungnickel J,Claus P,Gransalke K,et al.Targeted disruption of the FGF-2 gene effects the response to peripheral nerve injury[J].Mol Cell Neurosci，2004，25(3):444-452.

[12]胡文娟,黄巨恩,李校塑,等.改构型酸性成纤维细胞生长因子对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用[J].解剖学研究,2007,23(2):166-169.

(收稿2010-10-14)