急性缺血再灌注大鼠脑中γ-氨基丁酸A型受体α1mRNA的表达变化

【摘要】 目的 观察大鼠脑组织中GABA_ARα₁mRNA在脑缺血再灌注不同时段的表达及动态变化规律，探讨其在脑缺血再灌注损伤中的意义。方法 55只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、脑缺血2h再灌注6h、12h、24h、3d、7d组（手术组），及其相应的假手术对照组，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，至上述规定时间点后取大脑组织，利用地高辛标记寡聚核苷酸探针原位杂交技术与计算机分析系统在光学显微镜下观察GABA_ARα₁mRNA分别在相应海马区及大脑皮质阳性神经元的表达情况，以及相应海马区及大脑皮质的病理变化。结果 假手术组GABA_ARα₁mRNA表达同正常对照组相比没有明显改变。而各手术组GABA_ARα₁mRNA表达在脑缺血2h再灌注24h开始下降，3d下降显著，7d恢复正常。结论 GABA_ARα₁mRNA在急性脑缺血再灌注时含量降低可能为脑缺血再灌注损伤的重要原因。?
【关键词】 脑缺血再灌注；γ-氨基丁酸A型受体α₁mRNA；原位杂交?
【中图分类号】 R-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5110（2010）01-0001-03
Changes of expression of gamma-aminobytyric type A receptor alpha 1 mRNA after acute focal cerebral ischemia- reperfusion in rats
Zhang Junqing， Wang Wei，Xue Gang，et al. The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, China?
【Abstract】 Objective To observe the expression of GABA_ARα₁ mRNA and the dynamic regulation in the brain of rats in focal cerebral ischemia reperfusion, and investigate the significance in ischemia-reperfusion injury.Methods Fifty-five male Wistar rats were randomly separated into normal control, sham operation and ischemia-reperfusion operation by middle cerebral artery occlusion for 2 h and reperfusion 6,12,24-hour and 3,7 days. The changes of GABA_ARα₁ mRNA expression of hippocampus and cortex were observed under light microscope with digoxin labeled oligonucleotide probe in situhybridization method and computer aided image analysis. Results No difference was found in the expression of GABA_ARα₁ mRNA between normal and sham control group. However, compared with the normal and each control group, the expression of GABA_ARα₁ mRNA was decreased from 24 h and was the lowest within 3 d and recovered to normal in 7 d after ischemia-reperfusion. Conclusion It is suggested that the decreasing of content of GABA_ARα₁ mRNA after ischemia-reperfusion might be related with ischemia-reperfusion injury.?
【Key words】 Cerebral ischemia-reperfusion; GABA_ARα₁ mRNA; Situhybridization
　　γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统中重要的抑制性氨基酸，在神经元损伤中与主要的兴奋性递质谷氨酸（Glu）相抗衡。 GABA可阻断Glu兴奋性毒性，抑制细胞膜去极化和Ca²⁺内流，具有神经保护作用。介导GABA中枢效应的受体至少有三种不同类型，即GABA_A、GABA?B、GABA?C受体，其中以GABA_A受体分布最为广泛，在缺血性脑损伤的神经保护中占主导地位。哺乳类大脑中天然GABA_A受体主要是由α、β和γ亚基组成。其中α亚基对GABA_A受体复合物的组装及功能可能起主要作用。α₁与β₂和γ₂组成的GABA_A受体亚型在脑内数量最多,尤其在海马和大脑皮质最为丰富,约占全部GABA_A受体的43%。对GABA_A型受体α₁亚基基因的研究，目前多集中在癫痫^[1]、抑郁症^[2-4]等方面，在缺血性脑血管方面研究甚少。本研究以线栓法建立大脑MCAO模型，采用原位杂交技术对大鼠脑组织中 GABA_ARα₁mRNA进行检测，来观察γ-氨基丁酸A型受体基因在脑缺血再灌注损伤中的动态变化规律及其作用机制。
1 材料与方法?
1.1 研究对象 健康Wistar雄性大白鼠55只，体质量260～310g，由内蒙古大学动物试验中心提供。将动物随机分为：正常对照组，脑缺血2h再灌注6h、12h、24h、3d、7d组（手术组）及假手术对照组，每组5只。?
1.2 方法?
1.2.1 动物模型制作：采用右侧大脑中动脉线栓法(MCAO)，大鼠用10%水合氯醛（0.3ml／100g）腹腔注射麻醉，取仰卧位固定于鼠台，碘伏消毒后颈部正中切口，暴露右颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉近心端，血管夹夹闭颈内动脉，在近颈总动脉分叉处留置一条结扎线以便插线后固定鱼线，在颈总动脉近分叉处剪一约0.3mm小口，将头部蘸有石蜡的鱼线（线直径0.26mm，长50mm）经小口处插入，沿颈内动脉入颅，进线深度由分叉处算约20mm，稍感阻力时停止，此时已至大脑中动脉起始处，以活结结扎用于固定鱼线的结扎线，缝合手术切口，缺血2h后将线栓抽出，松开颈总动脉上的活结造成缺血再灌注模型,假手术对照组除不插鱼线外，其余步骤同缺血组。?
1.2.2 标本取材和石蜡切片制作：分别在上述规定时间点，给予大鼠10%的水合氯醛0.5ml腹腔注射麻醉，剪开胸腔经左心室快速输入0.9%氯化钠注射液，同时剪开右心耳，待血色变淡后快速输入4%多聚甲醛磷酸缓冲液（含有1/1000DEPC）固定脑组织，待鼠颈及四肢僵硬后，停止灌注，快速断头取脑置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液（含有1/1000DEPC）固定保存。取视交叉前后约4mm厚脑组织经常规脱水、浸蜡、包埋。石蜡切片连续冠状切片，42℃温水展开，片厚6μm，将石蜡切片贴于涂有多聚赖氨酸的切片上，置于60℃烤箱内过夜，放4℃冰箱待用。?
1.2.3 原位杂交过程： ①石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H₂O₂ 1份+蒸馏水10份混合,室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。 ②暴露mRNA核酸片段：切片上滴加1ml3%柠檬酸，100ul新鲜稀释的胃蛋白酶混匀，37℃或室温消化10min，原位杂交用PBS洗5min×3次，蒸馏水洗涤3次。 ③预杂交：干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20ul加预杂交液。恒温箱42℃ 4h。吸取多余液体，不洗。④杂交：按每张切片20ul杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱42℃杂交过夜。 ⑤杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温2×SSC洗涤5min×2次；37℃ 0.5×SSC洗涤15min×1次; 37℃ 0.2×SSC洗涤15min×1次。 ⑥滴加封闭液：37℃ 30min。甩去多余液体，不洗。⑦滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60min，原位杂交用PBS洗5min×4次。 ⑧滴加SABC：37℃ 20min，原位杂交用PBS洗5min×3次。 ⑨滴加生物素化过氧化物酶：37℃ 20min，原位杂交用PBS洗5min×4次。 ?B10?DAB显色：使用DAB显色试剂盒，1ml蒸馏水加显色剂Ａ、Ｂ、C各一滴，混匀，加至标本上。显色20min，充分水洗。 ?B11?苏木素复染，充分水洗。 ?B12?酒精脱水，二甲苯透明，封片PBS洗3次×5min。蒸馏水洗1次。
1.2.4 观察项目和统计学处理：在400倍显微镜视野下计数各组脑组织海马区及大脑皮层GABA_ARα₁mRNA阳性神经元数及观察GABA_ARα₁mRNA分别在相应海马区及大脑皮质阳性神经元表达的改变。采用江苏捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析，每张切片随机选取10个高倍视野，测量原位杂交的阳性神经元数目。采用SPSS 13.0软件进行统计处理，各组数据用均数±标准差(x±s〖WT5BZ〗)表示，所用统计学方法用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果?
2.1 阳性细胞计数比较 与正常对照组相比，假手术对照组GABA_ARα₁mRNA的表达无明显改变（P＞0.05），但与正常对照组及假手术对照组比，脑缺血2h再灌注24h海马区及大脑皮质GABA_ARα₁mRNA的阳性神经元数目减少，3d降至最低（P＜0.05），14d基本恢复正常水平（P＞0.05）。
表1 大鼠海马区GABA_ARα₁mRNA的阳性神经元细胞数比较（个/每视眼） 表2 大脑皮质GABA_ARα₁mRNA的阳性神经元细胞数比较（个/每视眼） 2.2 组织形态学改变 光镜下正常对照组和假手术组神经元形态学无异常，阳性细胞胞浆着色呈棕黄色；手术组海马区及大脑皮层部分神经元结构表现出坏死前样改变，包括细胞核浓缩、胞浆着色变淡、细胞结构不清，尤其在再灌注24h及3d时为著，缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶，灶内神经元残存较少甚至缺失。
3 讨论?
　　数十年来，人们对急性缺血性脑卒中病理生理机制的研究越来越深入，这应归功于脑缺血模型的制备。大鼠由于具有与人类脑血管相似的解剖基础及侧支循环情况、生理参数易控制性、价格低廉易得到而被广泛用来作为缺血动物模型的制作。目前，研究应用最多的是血管内线栓法造成MCAO局灶性模型。该模型无需开颅，对机体损伤性小，形成梗死灶较恒定，不会影响其他血管供血区域的局部脑血流量，且能控制缺血时间，形成有效再灌注。一方面，MCAO模型与人类临床常见的单一动脉，尤其是大脑中动脉闭塞一致，能较好模拟基底节区梗死；另一方面，人类大脑中动脉梗死常有自发性再灌注情况，MCAO模型通过线栓拔出实现血液再通，能够满足这一需求。因此，MCAO局灶性脑缺血模型被广泛用于神经元对缺血的敏感性、耐受性以及再灌注损伤病理机制和药物干预治疗等方面的研究。本研究以线栓法建立大脑中动脉栓塞模型，缺血2h再灌注不同时间点，大鼠不同程度的表现有缺血对侧肢体功能瘫痪的神经功能缺失现象，证明了模型制作成功。?
　　有研究显示^[5]，短暂性脑缺血后,GABAA 受体α₁ 、α₂ 亚单位mRNA呈双相变化。缺血早期发生再灌注后1h，主要表现为CA1 和CA3 区锥体细胞和颗粒细胞上mRNA 表达降低; 缺血晚期时,CA3 区细胞mRNA表达开始恢复至对照水平,而在CA1 区两种mRNA的表达仍较低,可持续到缺血后第3 天,与CA1 区锥体细胞分布一致。而Elena Alekseevna Kharlamov等^[6]研究显示，光化学诱导血栓性脑梗死后，GABA_ARα₁mRNA在梗死后7d下降明显，30d开始上升，说明缺血损伤后，其代偿机制具有复杂的时间依从性，GABA_ARα₁mRNA在梗死后7d下降，可能由于mRNA转录水平下降或者是mRNA稳定性下降导致。本研究结果显示，脑缺血2h再灌注24h时，GABA_ARα₁mRNA含量降低，3d时降至最低，推测，GABA_ARα₁mRNA〖JP2〗含量的变化与脑缺血再灌注损伤有关。与先前的研究相比较，GABA_ARα₁mRNA含量降低及恢复正常的时间段不同，〖JP〗这可能与所采用的试验方法与技术以及缺血模型制作方法不同有关。?
本试验应用原位杂交技术充分证实大鼠脑缺血再灌注24h～3d时脑组织中GABA_ARα₁mRNA的表达降低，提示缺血再灌注后〖JP4〗GABA_ARα₁mRNA转录受阻或其稳定性下降所致。若利用碱基配对原则人工合成氨基酸，作用于GABA_ARα₁mRNA〖JP〗转录过程，减轻脑缺血后再灌注损伤，可能达到脑保护作用。?
参考文献
[1] Brooks-Kayal AR,Shumate MD,Jin H, et al.Coulter DA (1999) Human neuronal -aminobutyric acid A receptors:coordinated subunit mRNA expression and functional correlates in individual dentate granule cells[J].J Neurosci,1999,19:8312-8318.
[2] Brambilla P,Perez J,Barale F,et al. GABAergic dysfunction in mood disorders[J].Mol Psychiatry，2003，8:721-737.
[3] Tunnicliff G.Malatynska E. Central GABAergic systems and depressive illness[J]. Neurochem Res, 2003，28: 965-976.
[4] Zul Merali,Lisheng Du,Pavel Hrdina, et al. Dysregulation in the suicide brain: mRNA expression of corticotropin-releasing hormone receptors and GABAA receptor subunits in frontal cortical brain region[J].Journal of Neuroscience,2004, 24(6):1478-1485.
[5] Li H,Siegel RE,Schwartz RD.Rapid decline of GABAA receptor subunit mRNA expression in hippocampua following transient cerebralischemia in the gerbil [J].Hippocampus,1993, 3(4):527.
[6] Elena Alekseevna Kharlamov,Kathy Louise Downey,Peter Isaac Jukkola. Expression of GABAA receptor α₁ subunit mRNA and protein in rat neocortex following photothrombotic infarction[J].Neuroscience，2008，19:29-38.
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