黄体酮对脑梗死大鼠脑部MMP-9、TIMP-1表达及血脑屏障通透性的影响

【摘要】 目的 观察黄体酮对脑梗死大鼠脑组织MMP-9、TIMP-1表达及血脑屏障通透性的影响。方法 制作SD大鼠永久性局灶性脑缺血模型(permanent middle cerebral arteryocclusion, pMCAO)，将大鼠随机分成假手术组、模型组、HBC溶剂治疗组和黄体酮治疗组。模型组、HBC溶剂治疗组和黄体酮治疗组，其中后3组设24h、48h、7d 3个时间点，每组每个时间点12只。应用干湿重法检测脑组织含水量；免疫组织化学法研究脑组织MMP-9、TIMP-1的表达情况。结果 模型组MMP-9、TIMP-1的表达及脑水含量在各个时间点与HBC溶剂治疗组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但在黄体酮治疗组脑组织中的表达较模型组和HBC治疗组明显降低（P<0.05）。结论 黄体酮可能通过调节MMP-9/TIMP-1表达,降低血脑屏障通透性，减轻脑缺血后脑水肿程度。?
【关键词】 脑缺血；黄体酮；基质金属蛋白酶-9；金属蛋白酶组织抑制剂-1；血脑屏障?
【中图分类号】 R743.33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5110（2010）01-0011-03
Effect of progesterone on the expression of MMP-9 and TIMP-1 and blood-brain barrier permeability after focal cerebral permanent ischemia in rats
Hao Yujin, Wang Jianping, Liu Chunling, et al.Department of Neurology of the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, China?
【Abstract】 Objective To study the effects of progesterone on the expression of MMP-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9) and TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1) and blood-brain barrier permeability in cerebral ischemia in rats. Methods Permanent middle cerebral arteryocclusion rats model (pMCAO) was used in this experiment. All rats were randomly divided into 4 groups: the progesterone treated group, the HBC treated group, the model group and the sham operated group. Except for shamed operated group, 12 rats were killed in each group at 24h, 48h and 7d post-occlusion, respectively. The brain water content was evaluated with dry-wet weight method. MMP-9 and TIMP-1 were measured by immunohistochemistry technique．Results In the progesterone treated group the brain water content and the expressions of MMP-9 and TIMP-1 were down-regulated compared with the model group and HBC treated group at each time point (P＜0.05). Conclusion Progesterone may relieve cerebral edema through balancing MMP-9 and TIMP-1 after cerebral infarction.?
【Key words】 Cerebral ischemia; Blood brain barrier; Progesterone; Matrix metalloproteinase-9; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1
    基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloProteinase-9，MMP-9)与金属蛋白酶组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)均在脑梗死的病理生理过程中发挥着重要的作用^[1]。?
    MMP-9在脑水肿的形成过程中具有重要的作用，而TIMP-1则对其具有一定的抑制作用^[2]。观察脑梗死后两者表达水平的变化对于评价药物的治疗价值具有重要的意义。近期国外的研究表明，黄体酮对脑损伤具有一定的治疗价值，其可以明显减轻脑组织含水量与促进神经功能的恢复^[3-4]。但是对于黄体酮减轻脑水肿的机制研究甚少。为了解脑梗死后脑组织中MMP-9和TIMP-1表达情况并探讨黄体酮减轻脑水肿的机制，特进行如下研究。
1 材料和方法?
1.1 动物与分组 Sprague-Dewley雄性大鼠(郑州大学实验动物中心提供)，清洁级，体质量250～300g，共120只。将大鼠随机分成假手术组、模型组、HBC溶剂治疗组和黄体酮治疗组。其中后3组每组设24h、48h、7d 3个时间点，每个时间点12只大鼠。?
1.2 动物模型制作及给药方法 采用线栓法制备大脑永久性局灶性脑缺血模型。假手术组只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入尼龙鱼线。选择苏醒后左上肢屈曲、行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验，否则视为栓堵失败，弃之不用。将黄体酮溶于22.5%2-羟丙基-β-环糊精（HBC）黄体酮治疗组于术后腹腔注射黄体酮1次(15mg/kg体质量)，以后1次/d；溶剂治疗组给予等体积的环糊精溶液治疗。?
1.3 脑含水量测定 每组每个时间点随机选取6只进行脑水含量测定。按麻醉后快速断头取脑，沿桥脑上界水平面切断，称取右半脑组织湿重，110℃恒温烤箱中烘烤48h，称取其干重，计算脑组织含水量= (湿重-干重)/湿重×100%。 ?
1.4 MMP-9及TIMP-1免疫组织化学检测 常规灌注取脑，切取视交叉到小脑前的冠状位切片，经4%多聚甲醛溶液后固定72 h，常规脱水石蜡包埋，作2μm厚的切片，HE染色。免疫组化染色采用SP法常规染色。MMP-9及TIMP-1免疫组织化学检测均以细胞质染为棕色为阳性,以PBS代替一抗作阴性对照,用以知阳性切片作阳性对照。每张切片取5个高倍视野,每个高倍视野查100个细胞数,计数其中阳性细胞个数。　?
1.5 统计学处理 实验数据用均数±标准差(x±s)表示。不同组同一时间点数据的比较采用单因素方差分析(LSD法)，方差不齐时采用秩和检验。应用SPSS for Windows 13.0软件包处理，取α=0.05作为检验水准。
2 结果?
2.1 大鼠脑含水量结果分析 模型组和HBC溶剂治疗组在梗死后不同时间点脑组织含水量与假手术组相比均有增高(P<0.05)。而黄体酮治疗组在各个时间点脑组织含水量则较模型组与HBC溶剂治疗组均明显降低，但仍高于假手术组(P<0.05)。详见表1。 注：*与假手术组比较结果有统计学意义（P<0.05），与模型组比较无差异（P>0.05）;?#与模型组及溶剂治疗组比较结果均有统计学意义（P<0.05）
2.2 MMP-9免疫组织化学染色结果分析 假手术组MMP-9的表强度较低；黄体酮治疗组MMP-9的表达强度在各个时间点均低于模型组与溶剂治疗组，且差异有统计学意义，详见表2。 注：*与假手术组比较结果有统计学意义（P<0.05），与模型组比较无差异（P>0.05）;?#与模型组及溶剂治疗组比较结果均有统计学意义（P<0.05）
2.3 TIMP-1免疫组化染色结果分析 TIMP-1在假手术组几乎未有表达；而在模型组梗塞后24h达到高峰，48h后开始下降；HBC溶剂治疗组和黄体酮治疗组亦有此规律，但黄体酮治疗组TIMP-1表达均低于HBC溶剂治疗组与模型组，且具有统计学意义，详见表3。 注：*与假手术组比较结果有统计学意义（P<0.05），与模型组比较无差异（P>0.05）;?#与模型组及溶剂治疗组比较结果均有统计学意义（P<0.05）
3 讨论?
    血脑屏障由毛细血管内皮细胞、基底膜及附着于基底膜外层的星型胶质细胞足突等构成,在维持神经系统内环境的相对稳定方面有着重要的意义。在正常生理情况下血管细胞外基质成分的合成和降解保持着动态平衡，而基质金属蛋白酶（MMPs）与金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)本身的平衡对维持这种平衡起到了重要作用。MMPs／TIMPs的失衡会影响到细胞外基质的合成与降解的平衡^[5]。在脑缺血过程中，表达增高的MMP-9通过降解细胞外基质导致脑微血管结构完整性破坏和血脑屏障损坏,造成继发性脑水肿和脑损伤^[6]。动物模型研究发现TIMP-1可能产生一种内源性保护作用^[7]，且TIMP-1还是MMP-9的特异性抑制剂，因此调节两者在梗死后脑组织中的平衡对维持基底膜细胞外基质正常代谢和血脑屏障完整性方面显得尤重要。?
    黄体酮属于神经甾体激素，是一种新的对中枢神经系统产生广泛影响的神经调质，并且在脑缺血的保护中具有重要作用^[8]。本研究通过建立大鼠永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)模型来观察黄体酮对大鼠脑缺血后脑水肿、MMP-9及TIMP-1表达的影响，了解其能否通过调节MMP-9／TIMP-1使其回复正常的平衡状态而起到脑保护剂的作用。结果表明MMP-9在脑缺血24h时表达增加，于48h达到峰值，7d时表达下降，其表达变化与脑水肿程度动态变化发生的时间一致。这也进一步证实了MMP-9与缺血后脑水肿的形成密切相关。研究同时发现应用黄体酮治疗后缺血半暗带内MMP-9表达有明显下降趋势，且脑水含量也较模型组及HBC治疗组明显降低。提示黄体酮可能通过抑制MMP-9的表达来减轻血脑屏障破坏,进而减轻脑组织损伤。实验亦发现TIMP-1在脑梗死后24h达到高峰，48h后下降。应用黄体酮干预后TIMP-1的表达明显降低。这可能与黄体酮通过抑制MMP-9的表达，从而使伴随MMP-9病理性表达升高的TIMP-1也相应减少；也可能黄体酮自身对TIMP-1有一定的抑制作用。?
综上所述，黄体酮可能通过调节MMP-9/TIMP-1来实现其神经保护作用。脑缺血后继发性脑水肿可能与增加的MMP-9破坏血脑屏障有关。通过干预因素调节MMP-9与TIMP-1之间的平衡，抑制MMP-9，调节TIMP-1，可能为治疗缺血性脑血管疾病提供新的靶点。?
参考文献
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