黄体酮对脑梗死大鼠缺血半暗带内IL-6的表达

【摘要】 目的 观察黄体酮对大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠缺血半暗带内炎症反应的抑制作用以及脑梗死体积的影响。方法 选择成年雄性S-D大鼠，体质量为250～300g，并将其随机分为假手术组、缺血组、溶剂治疗组、黄体酮治疗组。分别于6h、24h、72h三个时间点处死大鼠，取出脑组织，行免疫组化染色观察白介素-6（IL-6）的表达情况，并通过TTC染色检测脑梗死体积的变化。采用单因素方差分析，P＜0.05，差异有统计学意义。结果 脑梗死发生后，缺血半暗带内IL-6的表达水平明显增高，经黄体酮治疗后，其表达水平明显下降（P＜0.05），脑梗死体积较治疗前亦明显缩小（P＜0.05）。结论 黄体酮可以通过抑制大脑中动脉闭塞大鼠脑内炎症反应的程度，减轻梗死侧半球的脑损伤程度。?
【关键词】黄体酮；脑梗死；白介素-6；梗死体积?
【中图分类号】 R-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5110（2010）01-0018-03
Research on the influence of progesterone on expression of IL-6 in cerebral ischemia in rats
Chen Ningning, Wang Jianping, Liu Chunling, et al.Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, China?
【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effects of progesterone (PROG) on the expression of interleukin -6(IL-6) and infarct volumes after stroke.Methods All S-D rats, weighted 250～300g, were randomly divided into four groups: sham-operated group, ischemic group, vehicle-treated group and PROG-treated group. Immunohistochemistry technique was applied to detect the expression of IL-6 after MCAO 24h, 48h, 72h. Infarct volume of injured brain was examined with triphenyltetrazolium chloride stain (TTC). One-way ANOVA was used to check any changes in IL-6 and infarct volume of injured brain after MCAO.Results Following PROG treatment, expression level of IL-6 was significantly reduced in comparison with vehicle-injected controls（P＜0.05）. In addition, progesterone also significantly reduced infarct volume of injured brain compared with vehicle-injected rats（P＜0.05）.Conclusion PROG inhibits the degree of inflammatory reaction after experimental stroke and mitigates the severity of brain damage, it suggests that the neuroprotective effect of PROG on a permanent model of focal brain ischemia in rats.?
【Key words】 Progesterone; Cerebral infarction; IL-6; Infarct volume
    最新的研究表明，黄体酮（progesterone, PROG）对于中枢神经系统损伤具有一定的治疗价值，目前在国外已经进行了黄体酮治疗脑外伤的Ⅲ期临床试验阶段^[1]，效果满意。脑梗死与脑外伤后的病理变化有一定的相似之处，但是对于黄体酮对于脑梗死的神经保护作用研究甚少，所以本研究拟从炎症反应的角度去探讨黄体酮在脑梗死后的神经保护作用。

1 材料与方法?
1.1 实验动物与分组 成年雄性S-D大鼠96只，体质量250～300g，由郑州大学实验动物中心提供，以标准饲料喂养。按随机化原则分为4组，即假手术组(Sham)、缺血组(Ischemia)、溶剂治疗组(Vehicle)和黄体酮治疗组(PROG)。每组均设3个时间点:6h（32只）、24h（32只）、72h（32只）。?
1.2 大鼠MCAO模型建立及给药途径 采用Takaba等^[2]的线栓法建立大脑中动脉闭塞模型,假手术组仅分离血管,不插尼龙线。选择苏醒后左上肢屈曲、行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验，否则视为栓堵失败，弃之不用。将黄体酮溶于22.5%的2-羟丙基-β-环糊精(2-hydroxypropy-β-cyclodextrin，HBC)中，黄体酮治疗组于术后腹腔注射黄体酮15mg/kg^[3]体质量一次，以后1次/d；溶剂治疗组给予等体积的HBC溶液治疗。?
1.3 免疫组织化学检测缺血半暗带内IL-6的表达情况 常规灌注取脑，切取视交叉到小脑前的冠状位切片，经4%多聚甲醛溶液后固定72 h，常规脱水石蜡包埋，作2μm厚的切片，HE染色。免疫组化染色采用SP法常规染色。用VI-DAS-21显微图像分析系统测定缺血周围区的OD值。?
1.4 TTC染色检测脑梗死体积 不同时间点断头取脑，冷冻后等分切成2mm厚脑片，浸入37℃1%TTC溶液中染色30min。染色后将脑片浸入4％中性多聚甲醛固定保存，拍照后用Ulead Photo Express2.0图象分析软件进行脑梗死轮廓勾画，法医损伤测量软件测量脑缺血面积，算出每个大脑梗死体积。?
1.5 统计学处理 所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 13.0软件进行统计，不同组相同时间点差异显著性检验采用方差分析，组间比较采用LSD法。以α=0.05 作为显著性检验标准。
2 结果?
2.1 黄体酮治疗前后缺血半暗带内IL-6的表达情况 假手术组缺血半暗带内IL-6的表达水平在各时间点均比较低；模型组与溶剂治疗组则明显升高；黄体酮治疗组明显下降，与模型组以及溶剂治疗组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。 注：与模型组、溶剂治疗组比较，结果有统计学意义，?*P<0.05
2.2 脑梗死体积的变化 TTC染色结果表明黄体酮能显著减小脑梗死体积。经治疗后，脑梗死体积明显缩小；与模型组、溶剂治疗组比较，结果有统计学意义（P＜0.05），见表2。 注：与模型组、溶剂治疗组比较，结果有统计学意义，?*P<0.05
3 讨论?
    近年来黄体酮作为一种很有前途的脑保护剂己成为目前国内外的研究热点。首先，黄体酮有很宽的治疗时间窗，动物实验显示，伤后24h注射仍然有效抑制脑水肿的形成^[4]。这对缺血早期的脑保护治疗是很有价值的。第二，黄体酮在给药后1h内，就能够快速的通过血-脑屏障和血-神经屏障进入脑组织内并迅速达到平衡分布。第三，黄体酮和其他神经保护药相比，很少有不良反应，对机体组织是安全的。?
脑梗死的炎症反应是一个级联反应的过程，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是最初的启动者，IL-6是二级炎症介质的主要成分，主要由胶质细胞产生，包括小胶质细胞和星形胶质细胞。脑缺血及缺血再灌注后小胶质细胞迅速激活、增殖，并聚集于损伤部位，也说明其与脑缺血关系密切。?
IL-6在中枢神经系统的生理功能非常复杂，已证明脑梗死后IL-6会大量表达，其表达水平不仅与脑梗死体积有关，而且还与疾病的严重程度有关^[5]。有研究发现缺血早期其表达水平与脑梗死体积成正相关，后期脑室内注射IL-6或者是IL-6受体的抗体反而可以缩小梗死体积，说明IL-6在缺血性脑损伤中即有神经毒性又有神经保护作用，但最终作用方式可能与局部IL-6的浓度、靶细胞的类型以及受检时间有关。?
本研究针对脑缺血早期的大鼠，结果表明模型组缺血半暗带内IL-6的表达明显高于假手术组，也验证了IL-6参与了脑缺血后的早期的炎症反应。以2-羟丙基-β-环糊精为溶剂，黄体酮可以显著减少IL-6的表达及脑梗死的体积。以往的研究表明黄体酮可以降低TNF-α的表达以及减小脑梗死体积^[6-7]，与本研究结果相符。从而进一步证明了黄体酮可以通过抑制脑梗死大鼠脑部炎症反应的产生，减轻梗死侧半球的脑损伤程度来发挥其神经保护作用，为黄体酮用于脑保护治疗提供可行的理论基础。?
参考文献
[1] Vandromme M, Melton SM, Kerby JD. Progesterone in traumatic brain injury: time to move on to phase Ⅲ trials [J]. Crit Care, 2008, 12(3):153.
[2] Takaba H, Fukuda K, Yao H. Substrain differences, gender, and age of spontaneously hypertensive rats critically determine infarct size produced by distal middle cerebral artery occlusion [J]. Cell Mol Neurobiol, 2004, 24(5):589-598.
[3] Iqbal Sayeed , Bushra Wali , Donald G Stein. Progesterone inhibits ischemic brain injury in a rat model of permanent middle cerebral artery occlusion [J].Restorative Neurology and Neuroscience, 2007, 25:151-159.
[4] Wright DW，Bauer ME，Hoffman SW，et al. Serum progesterone levels correlate with decreased cerebral edema after traumatic brain injury in male rats [J]. Neurotrauma，2001，18:901-909.
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[6] Aggarwal R, Medhi B, Pathak A, et al. Neuroprotective effect of progesterone on acute phase changes induced by partial global cerebral ischemia in mice[J]. Pharm Pharmacol, 2008，60(6):731-737.
[7] Jiang C, Wang J, Li X, et al. Progesterone exerts neuroprotective effects by inhibiting inflammatory response after stroke[J]. Inflamm Res, 2009, 58(9):619-624.

通讯作者：王建平，博士及硕士研究生导师，郑州大学第五附属?医院神经内科教授。