U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型建立

汪柳旭¹⁾  朱凤军^2)△  廖建湘¹⁾  段  婧¹⁾  陈  乾²⁾  宋建明³⁾

深圳市儿童医院  1)神经内科  2)神经外科  3)病理科，广东 深圳 518038

基金项目：深圳市基础研究计划(20130310233932)

△通信作者：朱凤军(1983－)，男，硕士，副主任医师。研究方向：神经外科学。Email：zhufengjun128@126.com

【摘要】  目的  建立U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤温度变化情况。方法  将U87胶质瘤细胞接种到Balb/c裸鼠右侧背部靠右后肢皮下处，建立10只雌性裸鼠皮下移植瘤胶质瘤模型。测量肿瘤的体积，并绘制肿瘤生长曲线。观察神经胶质瘤的生长，监测肿瘤温度的变化情况。接种第36天处死裸鼠，取出肿瘤组织观察肿瘤标本的病理性特征和GFAP免疫组化的阳性表达情况。结果  胶质瘤裸鼠模型建立成功。病理学检查显示，肿瘤细胞符合胶质瘤细胞的形态学特征，GFAP阳性表达。在成瘤初期，肿瘤温度随时间增加而逐渐增加，到接种第15天，肿瘤温度上升至最高，在肿瘤生长后期，肿瘤温度随着时间增加而降低。接种第36天裸鼠肿瘤温度与接种第6天裸鼠肿瘤温度相比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论  有效建立U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型，在胶质瘤治疗方面有广泛的用途。

【关键词】  神经胶质瘤；裸鼠；动物模型；红外成像；皮下移植；温度；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)

【中图分类号】  R-332    【文献标识码】  A    【文章编号】  1673－5110(2018)03－0239－04  DOI：10.12083/SYSJ.2018.03.062

WANG Liuxu¹⁾，ZHU Fengjun²⁾，LIAO Jianxiang¹⁾，DUAN Jing¹⁾，CHEN Qian²⁾，SONG Jianming³⁾

1)Department of Neurology，2)Department of Neurosurgery，3)Department of Pathology，Shenzhen Children’s Hospital，Shenzhen 518038，China

Corresponding author：ZHU Fengjun，Email：zhufengjun128@126.com

【Abstract】  Objective  To establish subcutaneous transplantation model of U87 glioma in BALB/c nude mice and monitor the change of tumor’s temperature.Methods  Ten female BALB/c nude mice were inoculated subcutaneously which was on the back near right thigh of mice with tumor cells of the U87 glioma cell line.Subcutaneous transplantation model of U87 glioma in BALB/c nude mice were established.The volume of tumor was measured with a Vernier caliper.The growth lines of tumor were drawn.Using the infrared imaging to observe the growth of glioma and monitor the change of tumor’s temperature.The nude mice were killed on 36 days after the beginning of the inoculation.HE staining was performed to observe the morphologic properties of tumor and immunohistochemically staining was performed to detect the positive expression of GFAP in tumor sites.Results  The Establishment of neoplasm transplantation models of U87 glioma in BALB/c mice were successfully.The pathology of tumor was accord with the morphological features of U87 glioma cell.The expression of GFAP protein was positive in glioma tissues of tumor.At the early growth of tumor，the temperature of tumor increased gradually with the development of time.The temperature of tumor had reached the highest on 15 days after the beginning of the experiment.While in the late of tumor growth，the temperature of tumor decreased with the development of time.Compared the 36 days with 6 days after the beginning of the experiment，the of temperature of tumor had shown significance(P＜0.05)．Conclusion  Establishment of neoplasm transplantation models of U87 glioma in BALB/c mice is successfully.This animal model will be widely used in research of glioma treatment.

【Key words】  Glioma；BALB/C－nu mice；Animal models；Infrared imaging；Subcutaneous transplantation；Temperature；GFAP  

    神经胶质瘤简称胶质瘤，起源于神经胶质、室管膜、脉络丛上皮、神经元等，占颅内肿瘤40%，病因至今未明^[1－2]。儿童神经胶质瘤发病率约占颅内肿瘤的40%，是儿童最常见的颅内恶性肿瘤^[3]。目前多采用手术联合放疗、化疗共同治疗胶质瘤^[4－6]，由于胶质细胞异质性，可能导致治疗效果不佳^[7]。儿童神经胶质瘤早期发病时临床症状较轻微，确诊时多是肿瘤晚期，且儿童对手术、放疗、化疗等综合治疗的耐受性差，预后极差^[8]。临床上需要寻求新的有效控制神经胶质瘤生长的方法。通过建立成功的胶质瘤动物模型，为儿童神经胶质瘤治疗提供有效的研究平台。

    红外成像技术是指运用光电技术检测物体热辐射的红外线特定波段信号，将该信号转换成可供人类视觉分辨的图像和图形，并计算出温度值^[9]。医用红外成像就是利用正常组织与病变组织的温度差异而形成不同的红外图谱，从而实现早期诊断。红外成像的优点是没有损伤、准确度高、反应灵敏、操作简便^[10]。研究表明，红外成像技术可以早期发现肿瘤^[11]，最早用于乳腺癌的诊断。本实验建立U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型，利用红外成像技术，成瘤初期开始观察裸鼠肿瘤体积生长情况及肿瘤温度随时间变化情况。

1．1  主要试剂及仪器  DMEM培养液(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，新生小牛血清(澳洲GenStar公司)，PBS缓冲液(美国HyClone公司)，GFAP抗体(美国BioGenex公司)，DAB试剂盒(美国Ventana Medical Systems公司)，苏木精液(深圳达科为生物技术有限公司)，1%伊红液(深圳达科为生物技术有限公司)，中性树胶(深圳达科为生物技术有限公司)。水套式二氧化碳培养箱(美国Nuaire公司)，超净工作台(日本Airtech公司)，生物显微镜(奥林巴斯中国有限公司)，红外热像仪(广州飒特红外热像仪公司)。

1．2  接种细胞和实验动物  U87胶质瘤细胞株由中国科学院深圳先进技术研究院实验室提供。雌性Balb/c裸鼠10只，鼠龄4～6周，体质量15～20 g，由广东省医学动物中心提供(实验动物许可证号：SCXK粤2013－0002)，在无特定病原体(specified pathogen－free，SPF)条件下饲养，室温26～28 ℃，湿度40%～60%，用高压灭菌的饮用水和饲料定期喂养。

1．3  裸鼠皮下移植瘤模型建立  U87细胞在含有10%新生儿小牛血清，青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL的DMEM培养基中，5% CO₂孵箱、37 ℃条件下培养至对数生长期。取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，离心去上清液，用无血清DMEM培养液离心洗涤2次，计数细胞数，调整细胞浓度，将U87细胞悬浮于无血清DMEM培养液中，细胞浓度为1×10⁷个/100 μL。用带6号针头的1 mL注射器抽取混匀的细胞悬液100 μL，接种于裸鼠右侧背部靠右后肢皮下处。接种第12天，所有裸鼠肿瘤体积＞100 mm³。

1．4  裸鼠移植瘤生长曲线的测定  每日观察裸鼠精神、饮食、排便及活动情况，自接种第3天起每隔3 d称质量并用游标卡尺测量移植瘤体的长径(a)、短径(b)，按体积公式V＝1/2(a×b²)计算移植瘤平均体积，求其平均值并绘制肿瘤生长变化曲线。

1．5  HE染色  接种第36天处死裸鼠取出肿瘤，肉眼观察移植瘤形态、质地、活动度。用10%福尔马林固定肿瘤组织，石蜡包埋，组织切片常规脱蜡水化后，苏木素染色5 min，自来水冲洗3 min，伊红液染色3 min，自来水冲洗3 min，脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。

1．6  GFAP免疫组化  组织切片经PBS洗涤后脱蜡、脱水，3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶，切片浸入柠檬酸盐抗原修复液中，微波炉加热，10%山羊血清封闭非特异性结合位点，加一抗(GFAP 1：50)，4 ℃过夜，加二抗(1：100)，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。

1．7  红外热像成像  接种第6天及其后每间隔3 d测量一次红外热仪图像，采用CK350－M制冷型红外热像仪，每次测量日于15：00～17：00测量。测量时将裸鼠尾部及四肢固定于拍摄板，取肿瘤侧(右侧位)进行拍摄，红外热像仪与拍摄物体间每次距离为40～50 cm。将拍摄的图像用SatMedical V2.0.3软件处理后计算出肿瘤温度。

1．8  统计学方法  所有数据采用SPSS 16.0软件包进行两独立样本t检验，计量资料用均数±标准差(x±s)表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2．1  裸鼠生长情况及肿瘤生长曲线  接种初期，裸鼠食欲正常，体质量有所增加；接种第12天时，肉眼可见裸鼠皮下有一黄豆大小的肿块。在接种30 d以后，肿瘤大小增加明显，裸鼠逐渐消瘦，行动稍显迟缓，食欲减退。接种第36天处死裸鼠，所有裸鼠形成皮下移植瘤(图1A)。根据测量的肿瘤长径、短径计算出肿瘤体积，绘制出胶质瘤体积生长曲线图(图1B)。接种第36天时(即肿瘤处死时)肿瘤体积(1 397.6±205.8)mm³。

2．2  红外成像所测肿瘤温度变化  用SatMedical V2.0.3软件处理后计算出肿瘤温度，绘制肿瘤温度曲线(图2A)。如图2中接种第36天裸鼠肿瘤温度与接种第6天比较差异有统计学意义(P＜0.05)，肿瘤生长初期温度高于肿瘤生长后期温度。在接种初期，当肉眼不能明显观察肿瘤形态时，可以借助红外热像仪摄图了解肿瘤情况(图2B)。

2．3.1  HE染色结果：接种第36天处死裸鼠取出肿瘤，显微镜下肿瘤标本HE染色显示肿瘤细胞符合胶质瘤细胞形态特点(图3A)。

2．3.2  GFAP免疫组化结果：肿瘤组织经GFAP染色后，显微镜下观察肿瘤细胞GFAP阳性表达，证实肿瘤标本为胶质源性肿瘤(图3B)。

 

 

 

    裸鼠肿瘤模型常作为研究人类肿瘤生物特性以及肿瘤治疗的实验模型^[12]，其可以保留原发肿瘤本身的形态特征及遗传性。动物肿瘤模型中的移植性肿瘤模型应用广泛^[13－16]，该模型成瘤率高，均一性好，准确反映肿瘤的生物学特性。裸鼠皮下移植瘤模型操作简单，便于观察。本实验通过培养胶质瘤细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，为胶质瘤治疗的相关研究提供可靠的动物模型。目前移植性肿瘤动物模型较多使用Balb/c－nu裸鼠，源于该鼠无胸腺，细胞免疫功能低下，异种移植的排斥反应较低^[17]。Balb/c裸鼠为先天性免疫胸腺缺陷小鼠，T淋巴系统缺失。裸鼠常作为肿瘤体内耐药性和肿瘤细胞成瘤性的研究对象。U87MG细胞株来源于人类胶质瘤，与多形性胶质母细胞瘤类似，U87细胞常用于胶质瘤肿瘤的研究^[18]。

    胶质纤维蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是胶质纤维的特异性标记物，临床常用于胶质瘤的确诊^[19]。GFAP阳性表达程度有助于评估肿瘤组织的恶性程度。本实验中，所有肿瘤标本GFAP染色均阳性表达，证实所形成肿瘤为胶质源性肿瘤。

    同正常细胞相比，肿瘤细胞在生长初期新陈代谢快速，肿瘤细胞的生长速度高于其凋亡速度，短时间内肿瘤迅速增殖到相当大的数量，其在生长过程中的发热量高于正常组织。由于其他因素的限制导致肿瘤生长所需的营养供给不足，肿瘤生长到一定阶段后，生长开始趋于缓慢，肿瘤生长后期产热量低于肿瘤生长早期^[20]。本实验表明，利用红外成像系统，可以早期发现胶质瘤，分析裸鼠成瘤情况及是否出现转移等情况，对肿瘤生长进行无创监测。近年来，红外热像技术广泛用于乳腺疾病、恶性肿瘤、炎症、深静脉血栓等的早期发现^[21－25]，不同于CT、MRI、B超等影像检查，红外热像技术操作简便、无创，能够更早发现机体的病理变化，动态观察体表温度变化，对疾病进行早期诊断、治疗、干预。由于红外成像的多种优点，有待于广泛应用于临床医学领域。

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(收稿 2016－11－16  修回 2018－01－16)

本文编辑：夏保军

本文引用信息：汪柳旭，朱凤军，廖建湘，段婧，陈乾，宋建明．U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型建立[J]．中国实用神经疾病杂志，2018，21(3)：239－242.