目的 将理论与实践相结合，为建立可信度高、稳定性强、重复性好、更贴近人体生理病理的动物模型提供参考。方法 在对比四种不同造模方式利弊的基础上，选取较合适的方法制作200只脑出血大鼠模型。结果 通过对200只大鼠模型的实践操作，总结出造模过程中需要特殊注意的事项、操作技巧以及常用的四种造模方法的优缺点，并分析四种不同造模方法分别适应的实验类型和测量指标。结论 每种造模方法各有其优缺点，我们开展动物实验时要根据观测的指标和预期结果的不同来选择合适的造模方法进行实验，以提高动物实验的可信度。
大鼠脑出血动物模型的制作技巧
韩佳炜1) 王淑华2) 李桂平3) 郑健刚3)
1)天津中医药大学，天津 300193 2)中国人民解放军第254医院，天津 300142 3)天津中医药大学第一附属医院，天津 300381
基金项目：天津市应用基础与前沿技术研究计划(重点项目)，编号：15JCZDJC36900
△通信作者：郑健刚(1967－)，男，主任医师，教授。研究方向：老年脑病。Email：jgzheng2008@163.com
【摘要】 目的 将理论与实践相结合，为建立可信度高、稳定性强、重复性好、更贴近人体生理病理的动物模型提供参考。方法 在对比四种不同造模方式利弊的基础上，选取较合适的方法制作200只脑出血大鼠模型。结果 通过对200只大鼠模型的实践操作，总结出造模过程中需要特殊注意的事项、操作技巧以及常用的四种造模方法的优缺点，并分析四种不同造模方法分别适应的实验类型和测量指标。结论 每种造模方法各有其优缺点，我们开展动物实验时要根据观测的指标和预期结果的不同来选择合适的造模方法进行实验，以提高动物实验的可信度。
【关键词】 脑出血；大鼠模型；自体血注入法；注血方法；胶原酶诱导法；制作技巧；应用现状
【中图分类号】 R-332 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5110(2018)07-0707-05 DOI：10.12083/SYSJ.2018.07.178
The skills ofestablishing intracerebral hemorrhage rat model
HAN Jiawei1)，WANG Shuhua2)，LI Guiping3)，ZHENG Jiangang3)
1)Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2)People’s Liberation Army NO.254 Hospital，Tianjin 300142，China；3)First Teaching Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300381，China
【Abstract】 Objective Combining the theory and practice to provide a reference for establishing a high credible，stable and repeatable animal model that can be used to study human physiological pathology.Methods On the basis of comparing the advantages and disadvantages of the four different modeling methods，200 more cerebral hemorrhage rat models were established.Results Through making models of intracerebral hemorrhage in 200 rats，we observed the issues that requiring special attention in the modeling process，operation skills and four kinds of rat cerebral hemorrhage model's advantages and disadvantages，we also analyzed the experimental type and the measurement index.Conclusion Each modeling method has its own advantages and disadvantages.When we carry out animal experiments，we select the appropriate modeling method according to the observed indicators and the expected results to improve the credibility of animal experiments.
【Key words】 Intracerebral hemorrhage；Rats model；Autologous blood injection method；Blood injection method；Collagenase induced method；Operating skills；Application status
脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)指原发性非外伤性脑实质内出血，是脑血管病中发病急骤、病情严重、致残率高、病死率高的疾病[1]。其发病率在我国约占全部脑卒中的20%～30%，急性期的致死率为30%～40%[2]。该病好发于40～70岁人群，且近年来发病人群有趋于年轻化[3]。因此，探索脑出血发病原因、病理生理变化、脑损伤机制对于更好的预防和治疗脑出血至关重要。建立能切实模拟人类脑出血机制和病理生理变化、稳定性高、可重复性好的动物模型，是开展动物实验研究的必要前提。其中大鼠因价格低廉、容易获取、易于管理且大鼠脑尾壳核是脑内最大的核[4]，易于实验中立体定位，而尾壳核又属于基底节，基底节又为人类脑出血的好发部位，所以在实验中用大鼠脑尾壳核出血模拟人脑出血已被广泛应用[5]。目前，已经积累了大量成熟的生理、病理、药理、形态学和遗传学方面的相关实验基础资料。现就大鼠应用于脑出血实验研究的现状作以综述，并且分享200例大鼠二次自体注血法脑出血手术过程中操作感悟以及操作技巧，以供研究人员选择最合适的造模方法开展实验研究，提高动物实验的相似度和可信度。
1 造模方法
根据目前大鼠脑出血动物模型实验相关文献总结，造模方法总体可以分为四类[6-9]：自体血注入法、胶原酶诱导法、微球囊充胀法、自发性脑出血。
1．1 自体血注入法 该方法是注射动物非肝素化自体血，形成的脑出血模型十分接近人类脑出血，适合用于研究脑出血的自然发生发展过程和病理生理形态学的特点，能模拟血肿占位数效应以及脑出血过程中血液成分中各种因子对脑组织代谢和血流量的影响，并可探索脑出血后继发的脑损害与脑水肿的形成机制，血凝块释放的毒性作用，损伤脑组织局部的炎性反应以及出血后细胞凋亡机制，是目前应用最广泛的一种造模方法。但该方法也存在一定缺点，血肿的形态和大小无法确定，导致模型间存在的一定的差异，而且血肿压力不确定容易胀裂脑组织流入脑室。注血速度稍快血液就会沿针道反流，这一缺点目前通过减慢注射速率延长留针时间，增加注血次数已得到有效改善。
1．1.1 取血方法：实验中多采用的取血方法有：大鼠内眦取血、断尾取血、尾动脉穿刺抽取、股动脉穿刺抽取、心脏穿刺等方法。然而，目前尚无各取血方法之间的详尽对比，现将其各适用范围比较总结如下。
1．1.1.1 内眦取血：其优点是简单易行、血液标本不易被污染、一次采血量2～3 mL，且对大鼠的创伤小。但其缺点相对明显，内眦取血多为眶后静脉丛的静脉血，与脑出血多为动脉破损造成出血不相吻合，因动静脉血含氧量不同等差异，导致静脉血不能完全模拟动脉血管破损造成脑出血的生理过程[10]。
1．1.1.2 断尾取血：其优点为操作简单易行、对大鼠创伤小、不会影响大鼠肢体功能活动，成功率高，基本无死亡。其缺点为血液标本易被污染，易混杂鼠尾部的毛和皮屑，且鼠尾取血为动静脉的混合血伴有组织液，注入脑组织后不能完全模拟人类脑出血动脉血管破损造成的生理过程，因此不建议采用于脑出血动物模型的实验研究。
1．1.1.3 尾动脉穿刺取血：优点为血液为相对纯净的动脉血，手术不影响大鼠肢体功能，且操作相对简单，成活率也相对较高，故该种取血方法为脑出血动物实验中比较推荐的。本次实验采用的亦是尾动脉穿刺取血。
1．1.1.4 股动脉穿刺取血：优点为血液为相对纯净的动脉血，但该方法缺点相对较多，手术取血操作相对麻烦，要求实验者技术熟练，术后会影响大鼠的肢体活动，影响对于脑出血大鼠造模是否成功的行为学评分，且该方法成功率较低[11]，故实验中应用的相对较少。
1．1.1.5 心脏穿刺取血：其优点为心室腔穿刺取血时间短、不易凝血、简便易行、损伤小等优点。缺点为：对于实验操作人员的要求相对较高，必须有熟练的操作技能，穿刺位点必须准确，避免反复穿刺以致大鼠死亡[12]。
1．1.2 注血方法
1．1.2.1 二次注血法：1996年DEINSBERGER提出二次注血法制作大鼠脑出血动物模型[13]。在1982年ROPPER[14]首次应用自体血注入建立脑出血动物模型基础上，将自体血分两次注入脑组织，这种办法延长注射时间、减慢注射速率，有效的减少了血液沿针道反流的现象，同时也避免了血液进入脑室和蛛网膜下腔[15]。
1．1.2.2 三次注血法[16]：与二次注血法相比，可用于出血量更大的模型的一种注射方法，这种注射方法既能有效的防止血液沿针道反流至硬膜下腔，同时又可以避免注入速率过快导致脑内局部压力迅速升高从而血肿冲破脑室。所形成的血肿形态大小部位更为稳定[17]，成功率约为75%[18]。
1．2 胶原酶诱导 脑内注射胶原酶诱导脑组织出血。胶原酶是一组能特异降解血管内皮细胞间基质下基底膜胶原成分的基质金属蛋白酶，主要分布于人体脑血管内，存在于巨噬细胞和单核细胞内，病理情况下，可以被释放激活。胶原酶有很多种，其中Ⅶ型胶原酶在制备脑出血动物模型中应用最为广泛[19]。这种方法制备的脑出血模型有其特有的优点：模型的成功率和稳定性较高，造模方法相对简便[20]，能比较好的模拟人类自发性颅脑出血[21]以及出血后血肿持续扩大的情况[20，22]。但缺点是胶原酶会有较明显的炎症反应[21]，对血管也会产生破坏作用[23]，故不适用于脑出血后炎症反应机制的研究。且其形成的并非真正意义上的血肿，而是弥漫性渗血，故出血量大小难以控制[24]，重复性相对较差。与注自体血法造脑出血模型相比，该方法造模因凝血酶对脑组织有直接细胞毒性作用[25]，对血脑屏障的损害程度更为严重，神经功能缺损程度也更重[26]，恢复时间较长[27]。故更适用于评估脑出血后各类指标的长期的观察。
1．3 微球囊充胀法 SINAR等[9]向脑内插入微球囊，充胀球囊以模拟脑出血血肿压迫脑组织使颅内压升高的状况，这是一种机械的脑出血模型制作方法。该方法的优点是能人为控制血肿机械压迫的范围，可复制性强，同时也避免了自体血注入法导致的血液破入脑室或血肿形态不一，但也存在其明显的缺点，不同于真正意义上的脑出血，没有血液成分的参与，不能用来评价脑出血后血凝块的毒性作用、引起的一系列细胞毒性反应以及血液本身的成分如凝血酶、血红蛋白、脑红蛋白等因素造成的损害，故近年对于脑出血的研究已经较少采用。但可用微球囊充气和放气的过程模拟血肿形成和清除的过程，可用于探索外科血肿清除术的最佳开展时机[28]。
1．4 自发性脑出血 目前主要有两种：一种是通过改变遗传基因而获得的自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive cerebral hemorrhage in rat，SHCHR)[29]。该种鼠卒中率高，能重现人类自发性脑出血发病的全过程[30]，但出血部位和出血量难以控制，而且该种鼠难于获得，易变种、断种，饲养困难，价格昂贵，所以限制了其在实验中的普及应用。另一种是肾原性高血压大鼠[8、31]，用银夹钳夹住大鼠双侧肾动脉，制作出该模型。该模型优点是造模简单，易于饲养。但与自发性高血压大鼠相比，两者都存在出血部位及出血量无法控制的缺点，且该种方式制作的大鼠模型自发性脑出血的发生率比较低，更不利于实验中广泛应用。
1．5 本研究大鼠脑出血动物模型的建立 此次研究，我们采取自体血注入造模，在尾动脉穿刺取血，行二次注血法，具体操作如下：在室温条件下，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mL/kg)，将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，使门齿沟平面比耳尖线平面低2.4 mm，此时前囟和后囟基本保持在同一平面上。固定时先固定耳尖线，听到水平针穿破骨膜的声音后，再移位至正中，接着固定门齿于门齿沟上。常规备皮消毒头皮正中，在消毒部位正中剪一小口，分离皮下组织，用30%双氧水腐蚀颅骨腱膜及颅骨外膜，暴露前囟及冠状缝，在前囟前0.6 mm中线旁3 mm处，用电钻钻直径1 mm的圆孔，深度达硬脑膜表面，不损及脑组织。用微量注射器取不抗凝自体尾动脉血55 μL，然后将微量注射器固定于立体定位仪的上方，将针尖沿钻孔膜垂直进针，深度约6 mm，以10 μL/min速度缓慢注射20 μL血液后静置5 min(如图1)，再以同样的速度注射剩余的35 μL，注射完成后，针尖静置10 min后缓慢退针。留针期间用酒精棉球包扎鼠尾端伤口。退针后，用医用无菌骨蜡封闭骨孔，无出血后缝合头部皮肤，创伤处用碘酚消毒，并喷以青霉素以防感染。
图1 自体血注入法脑出血大鼠模型
2 制作技巧
经过预实验60只和正式实验的140只大鼠模型的制作，不断积累经验探索并解决出现的问题，总结如下脑出血大鼠模型的制作技巧以及手术过程中注意事项：
2．1 实验时间选择 造模时间尽量选择冬季，夏季易发生感染，较冬季成活率低。
2．2 麻醉 麻醉时，采用新鲜配置的水合氯醛进行麻醉，尽量做到麻醉量一次到位，否则大鼠手术过程中会出现挣扎，严重影响定位精准度，如剧烈挣扎无法进行手术操作再补麻药时，补充剂量很难拿捏，很容易造成过量麻醉死亡，无形之间增加了实验成本。
2．3 固定 每次使用立体定位仪前，务必校准调零，定位大鼠过程中，一定要将大鼠头部牢固固定，防止手术过程中因大鼠挣扎而使定位不精准、血肿部位有偏差，但同时也要注意不要因固定过紧影响大鼠呼吸，造成大鼠缺氧死亡。
2．4 手术过程中操作注意
2．4.1 钻孔之前：在定位完成后钻孔之前，用黑色记号笔在进针点标记“十”字符号，“十”字交点即为钻孔处，因手术过程中大鼠会出现皮下出血，若出血过多会掩盖已经准确定位的进针点，所以为了避免该情况的发生而影响实验进程，最好定位后标记，节省时间。
2．4.2 钻孔时：使用电动颅骨钻时，右手持仪器，一定要用左手托着右手，因大鼠颅骨相对较薄，容易钻透，手下稍有落空感即已经钻透。如不用左手抵住，右手悬空，钻透后由于惯性作用会使右手插入脑组织，导致脑组织严重受损，影响实验模型的均衡性同时也对大鼠脑组织造成不可逆的损伤。
2．4.3 注入自体血时：如果实验采用自体注血法，取血操作应熟练迅速，以免血液凝固，难于注入。注入自体血和胶原酶的过程中，注入的速度一定要缓慢、均匀，该环节也是造模成败的关键环节，如操作不当或注入速度过快而引起脑内压力迅速增高，血肿冲破脑室，严重者可直接致死。退针过程中操作务必缓慢，并且保证注入后让大鼠静止10 min，待血肿形成后缓慢推针，以免注入的自体血或胶原酶沿针道反流或流入蛛网膜下腔，造成模型之间存在差异，影响实验结果。
2．4.4 术后感染的预防：术后缝合部位碘酒消毒，并腹腔注射青霉素或庆大霉素以防感染，提高模型的成活率，有助于实验能顺利开展。
3 讨论
综上所述，实验过程中需注意以上细节，能有利于实验的顺利开展。采用自体血注入或胶原酶注入法建立大鼠脑出血模型的时候，注入的速度为关键环节，稍有不慎会导致大鼠死亡，目前国外多采用自动化的电子微量注射器，能精准的掌握注入的速率，但由于设备价格昂贵，国内实验室普遍采用人工掌握速率注入的方法，很难做到匀速推注，降低了模型的成活率和稳定性，还有待于进一步发展。
而对于造模方法的选择，每种造模方法各有其优劣，我们开展动物实验时要根据观测的指标和预期结果选择合适的造模方法进行实验，以提高动物实验的可信度。如：自体血注入法和胶原酶诱导法为目前动物实验中应用相对广泛的两种造模方法，如果观测脑出血早期形成过程以及病理生理形态学变化，自体血注入法则更为合适；如果观测时程较长的功能预后情况应选择胶原酶诱导模型更为合适。然而目前尚没有一种模型能完全模拟人类自发性脑出血的整个过程。理想的脑出血动物模型应满足以下几点：(1)出血量固定；(2)造成的血肿的范围固定，压迫程度固定；(3)与人类脑出血后生理病理状态吻合，有利于各种继发性损害以及出血后诱导产生的各因子的定性定量研究；(4)简便廉价易于获取，可重复性好等等。
未来探索更为贴近人类生理病理的动物模型，可以尝试两种或两种以上造模方法的合并应用，如将自发性脑出血大鼠模型与人工诱导脑出血大鼠模型相结合，并做相应的改进将有可能获得更加贴近的动物模型，还可以应用一些现代超声技术，进行超声下穿刺造模，使定位更加精准模型更加稳定，如ZHOU[32]等就利用超声波对脑血管的显像作用，在超声探头的指引下精准的制作出犬大脑中动脉出血模型，这对于脑出血大鼠动物模模型的制作也是一种指引。因此，在未来的实验中，还需要我们不断探索设想并付诸于实践，朝着能建立一种更加贴切稳定可重复性好的动物模型的方向努力，从而推动脑出血实验研究的进展，指导临床治疗。
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(收稿2017-11-14 修回2018-02-28)
本文编辑：张喜民
本文引用信息：韩佳炜，王淑华，李桂平，郑健刚．大鼠脑出血动物模型的制作技巧[J]．中国实用神经疾病杂志，2018，21(7)：707-711.
