肉毒毒素抗癫痫作用的研究进展
黄 智 连亚军△ 武守义
郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052
基金项目：国家自然科学基金面上项目(81371438)
△通信作者：连亚军(1964－)，女，博士，教授。研究方向：癫痫、脑血管疾病、肌张力障碍。Email：lianyajnu369@sina.com
【关键词】 肉毒毒素；BoNT；中枢神经系统；癫痫；SNAP－25；神经递质；Na＋通道；鼻腔给药
【中图分类号】 R742.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673－5110(2018)03－0336－04 DOI：10.12083/SYSJ.2018.03.086
肉毒毒素(botulinum neuro toxin，BoNT)是一种由厌氧梭状芽孢杆菌产生的神经毒素蛋白[1]，可阻碍周围神经元轴突末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉弛缓性麻痹、腺体分泌减少等，被广泛应用于医学、美容等行业[2]。根据抗原学分类，BoNT可分为8类，依次命名为BoNT/A－H，并可依据氨基酸序列进一步区分亚型[3]，如A型肉毒毒素(botulinum toxin A，BoNT/A)可分为7种亚型(A1－A7)，各亚型具有不同的酶活性及毒理学特征[4－6]。
厌氧梭状芽孢杆菌合成并释放无活性的BoNT前体，BoNT由1条分子质量约150 kD的蛋白链构成，可被自身的蛋白水解酶降解、激活，活化后的BoNT由1条约100 kD的重链和1条约为50 kD的轻链构成，并依靠一个二硫键相连接。重链的C末端特异性识别神经元表面神经节苷脂、突触囊泡蛋白2、成纤维细胞生长因子受体[7－8]，介导轻链以囊泡的形式进入胞质，并参与囊泡的酸化，轻链的N末端允许其进入胞质。轻链作为BoNT的活性部分，具有Zn2＋依赖的蛋白水解酶活性，可降解1种或2种构成可溶性N－乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型的蛋白受体(soluble N－ethylmaleimide－sensitive fusion protein attachment protein receptors，SNAREs)复合体的蛋白质，抑制神经递质的释放。
在递质囊泡运输过程中，SNAREs起到至关重要的作用[9]。根据其分布及功能，SNAREs分为靶膜上的SNAREs(target membrane SNAREs，t－SNAREs)和囊泡上的SNAREs(vesicle membrane SNAREs，v－SNAREs)，其中t－SNAREs包括突触融合蛋白(syntaxin)、突触囊泡相关蛋白25(SNAP－25)，v－SNAREs包括突触小泡缔合性膜蛋白(synaptic vesicle－associated membrane protein，VAMP / synaptobrevin)及其相关蛋白。Synaptobrevin、syntaxin 和SNAP－25聚合成SNAREs复合体，介导囊泡膜与细胞膜结合并形成融合孔，融合孔扩张，释放神经递质[10]。BoNT降解囊泡运输过程中相关的SNAPEs蛋白，阻碍神经递质的释放，如BoNT/A、BoNT/C、和BoNT/E水解SNAP－25，BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F，和BoNT/G水解synaptobrevin，BoNT/C水解SNAP－25，及syntaxin[11]，而BoNT/H于2013年被发现，因其潜在的剧毒性，相关的研究报道较少[12]。
在周围神经系统中，BoNT主要抑制神经肌肉接头、自主神经末梢乙酰胆碱递质释放，作用机制较为单一，而对于具有多种神经递质的中枢神经系统，其作用范围更加广泛、复杂，现将其对在中枢神经元的影响概括如下。
1 抑制神经递质释放
既往普遍认为BoNT作用于胆碱能运动神经元、自主神经系统神经元，但实验表明BoNT可进入多种神经元，并阻滞非胆碱能神经元突触的神经递质释放。众多神经元体外培养证实，BoNT/A可抑制谷氨酸、L－天冬氨酸、5－羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺、γ－氨基丁酸、脑啡肽、甘氨酸、P物质、ATP、降钙素相关基因肽[13－19]。
2 抑制神经元兴奋性
BoNT抑制多种神经递质的释放，包括兴奋性神经递质(谷氨酸、L－天冬氨酸)和抑制性神经递质(γ－氨基丁酸)，对神经元的兴奋性具有一定的影响。Bigalke 等报道BoNT/A可抑制小鼠脊神经元的兴奋性和抑制性突触后电位[20]，随后证实BONA/A、BoNT/C、BONE/E抑制自发性、诱发的兴奋性突触后电位[21]。研究[18]表明，相较于抑制性神经递质，BoNT对兴奋性神经递质的抑制作用更显著 。在大鼠海马组织中，与谷氨酸能神经元相比，γ－氨基丁酸能神经元内SNAP－25含量较低，对BoNT－A、BoNT－E的抵抗作用较强，大剂量的BoNT－A才产生抑制作用[22]。
3 抑制Na＋通道
SHIN等[23]发现，BoNT/A抑制河豚毒敏感、不敏感性Na＋通道，呈剂量依赖性，且对中枢性神经元的抑制作用强于周围神经元细胞。A2型较A1型抑制作用更强，对Na＋通道的抑制作用强于抗癫痫药物(苯妥英、拉莫三嗪)，证实BoNT/A2 可影响海马CA1区神经元Na＋电流波幅，表现为前期波幅短暂增加，随后出现持续8～10 min的波幅降低。作者认为前期短暂的波幅增加同BoNT重链介导的轻链穿过细胞膜相关，进而推测BoNT结合钠离子通道的位点位于细胞膜内[23]。
4 逆轴突转运及转胞吐作用
通常认为BoNT作用于局部，而忽略了其可扩散至远端组织。目前研究[24]表明，BoNT具有逆轴突转运及转胞吐作用，可逆行性传递至中枢神经系统。因BoNT/A特异性切割SNAP－25，可将切割后的cSNAP－25(cleaved SNAP－25，cSNAP－25)作为BoNT的标志物。ANTONUCCI等[24]在大鼠一侧的海马区注射BoNT/A，可在同侧内嗅皮质、对侧海马区探及cSNAP－25，并抑制对侧海马的活动。在视区顶盖、晶须处注射BoNT/A，在视网膜突触末端、面神经核检测到cSNAP－25，后续研究在视网膜双极细胞、感光细胞内发现突触囊泡数目异常增多，证实了BoNT可经转胞吐逆行并发挥作用[25]。Matak等[26]在大鼠坐骨神经内注射BoNT/A，在脊髓前角胆碱能神经元内探及cSNAP－25，且该传导可被秋水仙素抑制。一项在对脑卒中患者外周肌内注射BoNT研究中发现BoNT/A可通过轴索运输至脊髓，抑制脊髓回返旁路与任肖细胞间乙酰胆碱释放，降低脊髓回返抑制途径[27]。BoNT逆轴突转运及跨突触传递的机制尚未明确，具体过程还需进一步研究。
5 可逆性损害认知、记忆等高级功能
在动物脑组织内给予BoNT，可抑制5－羟色胺、多巴胺递质的释放，与离体神经元培养结果相符[28－29]。在成年大鼠内嗅区皮质注射BoNT/B，可出现学习和记忆功能损害[30]，另一项研究显示，在小鼠脑室内注射BoNT/A、BoNT/B，小鼠出现一系列症状，如立毛、体质量降低、体温下降、眼睑闭合、反射消失、呼吸困难甚至死亡[31]，而采用亚致死剂量，小鼠出现辨别新事物等行为障碍[32]。COSTANTIN等[33]实验表明，该认知功能损害具有可逆性，将BoNT/B注射至海马区域，大鼠出现了为期5周的可逆性的空间学习、记忆功能损，且持续时间与BoNT/B代谢的时间相符。尽管该研究表明BoNT对大鼠的学习、记忆功能可随BoNT的降解而恢复，但尚缺乏长期用药的研究及对大鼠行为学影响的全面评估，及对中枢不同神经核团的影响。
癫痫是多种原因引起的脑部神经元高度异常同步化放电所致的临床综合征，具有持续存在的能产生癫痫发作的脑部持久性改变[34]。癫痫的发病机制复杂，目前认为是中枢神经系统的兴奋性与抑制性失衡所致，与兴奋性、抑制性神经递质、离子通道、神经胶质细胞、遗传、炎症、免疫等有关[35]。上述实验证实BoNT可阻碍多种神经递质的释放，对兴奋性神经递质抑制作用较强，为治疗癫痫提供了理论依据。
COSTANTIN[33]于2005年报道在大鼠单侧海马预注射BoNT/E，可抑制Ca2＋依赖性钾通道诱发的谷氨酸释放、海马锥体细胞的尖波电活动，显著抑制海人酸诱发的局灶性及全面性癫痫发作，增加电刺激诱发癫痫发作的阈值，延迟癫痫的发生，减少神经元凋亡。在海马组织中，cSNAP－25可存在3周以上，注射后1周行水迷宫训练，BoNT组出现学习记忆障碍；而cSNAP－25经过5周后不能检测到，此时BoNT组水迷宫测试与空白组无明显差异，证实了BoNT/E可抑制癫痫发作，对认知功能的损害具有可逆性，与经典抗癫痫药物苯妥英钠对照中，进一步证实BoNT/E更为有效。
ANTONUCCI等[36]进一步研究了BoNT/E对于慢性癫痫模型的影响，在小鼠海马注射海人酸诱发癫痫持续状态3 h后给予海马区注射BoNT/E，可延长慢性癫痫的潜伏期，但治疗组和对照组均出现慢性癫痫，每日的发作次数及时间无差异。在海人酸注射侧海马CA1区神经的元丧失及齿状回细胞分散程度降低[37]。该试验揭示了BoNT/E在癫痫形成中的保护性作用，但对慢性癫痫的产生无明显影响。而另一项研究选取海人酸注射3周后的慢性癫痫模型，给予海马区注射同等计量的BoNT/E，发现可降低大鼠每日癫痫的发生次数及持续时间。
BoNT/A、BoNT/B同样具有抗癫痫作用，在杏仁核点燃模型中，二者均增加电刺激的阈值，抑制谷氨酸释放，呈现剂量、时间依赖性，其中BoNT/B可持续50 d，较BoNT/E明显延长[38]。在对于 BoNT/A的不同亚型研究中，在杏仁核点燃模型中海马注射等剂量的A1、A2型BoNT，并统计术后电刺激的阈值及癫痫发作状态，发现BoNT/A2可提高电刺激阈值，降低痫性发作，而BoNT/A1组较空白组无明显差异[39]，可能因A1型扩散速度较A2型快，A1型扩散范围较广，局部不能形成有效浓度，不能抑制局部电刺激诱发的癫痫发作。
以上研究均采用颅内海马区局部注射，操作具有创伤性及感染风险，在实际操作中具有一定的难度，不利于应用到临床实践中，应进一步探究颅外无创给药途径。近年来研究发现，经鼻腔给药可经嗅神经、三叉神经通路传递至中枢神经系统，并具有绕过血脑屏障、生物利用度高、无肝脏首过效应等特点[40]，被用于研究帕金森病、脑缺血、阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的治疗[41－42]。嗅神经可投射至脑的不同区域，如梨状皮质、杏仁核、下丘脑等[43]，目前实验证实鼻腔给予miR－146a mimics可延迟氯化锂－匹鲁卡品癫痫模型的癫痫发作[44]。因BoNT的逆神经转运、转胞吐作用，利用嗅神经传导通路，可探究鼻腔内给药对于癫痫发作的影响。
后续可进一步利用BoNT不同的类型的酶活性及毒理学特征，如BoNT/A半衰期时间长，可能作为潜在的长效抗癫痫药物，避免常规抗癫痫药物需长期、规律服用的弊端；BoNT/E作用时间短暂，可应用于癫痫外科，对不能明确的手术切除部位暂行局部注射，有助于进一步精确定位。综上，目前研究表明，BoNT可抑制神经元兴奋性，减少癫痫的急性期发作及慢性自发癫痫发作，降低神经元损伤、脑部异常放电，为癫痫的治疗提供了新的途径，但目前尚处于实验阶段，还需进一步探索。
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(收稿2017－09－21 修回2018－01－10)
本文编辑：张喜民
本文引用信息：黄智，连亚军，武守义．肉毒毒素抗癫痫作用的研究进展[J]．中国实用神经疾病杂志，2018，21(3)：336－339.
