芹菜素对胶质瘤U87细胞的抗增殖作用及其机制研究
贡伟一 程 峰 刘 华 张曙光△
江苏大学附属昆山医院神经外科，江苏 苏州 215300
基金项目：江苏大学2016年度医学临床科技发展基金(JLY20160042)
△通信作者：张曙光(1971-)，男，硕士，副主任医师。研究方向：胶质瘤的基础与临床研究。Email：kssg@163.com
【摘要】 目的 探讨芹菜素对人胶质瘤细胞的抑制作用及其分子学机制。方法 人胶质瘤U87细胞给予0、20、40 μmol/L芹菜素，通过MTT评价细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡。进一步U87细胞转染Bak1 siRNA，24 h后给予芹菜素刺激，体外观察细胞的增殖和细胞凋亡情况，Western blot检测Bak1表达。结果 芹菜素可有效抑制胶质瘤细胞生长，诱导其凋亡。抑制Bak1 表达后，芹菜素抑制胶质瘤增殖能力下降，未见细胞发生凋亡。结论 芹菜素抑制胶质瘤细胞生长促进其凋亡是通过活化Bak1蛋白实现的。
【关键词】 芹菜素；胶质瘤；增殖；凋亡；Bak1
【中图分类号】 R-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5110(2018)01-0012-04 DOI：10.12083/SYSJ.2018.01.003
Apigenin inhibits glioma cell proliferation by activating Bak1
GONG Weiyi，CHEN Feng，LIU Hua，ZHANG Shuguang
Department of Neurosurgery，Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Suzhou 215300，China
【Abstract】 Objective To explore the inhibitory effect of apigenin on human glioma and its molecular mechanism.Methods Human glioma U87 cells were treated with 0，20，and 40 μmol/L apigenin.Cell proliferation was evaluated by MTT，and apoptosis was detected by flow cytometry.U87 cells were further transfected with Bak1 siRNA，and stimulated with apigenin after 24h.The proliferation and apoptosis of the cells were observed in vitro，and the expression of Bak1 was detected by Western blot.Results Apigenin can effectively inhibit the growth of glioma cells and induce apoptosis.After inhibiting the expression of Bak1，apigenin inhibited the proliferation of glioma cells，and no cell apoptosis occurred.Conclusion Apigenin inhibits glioma cell growth and promotes apoptosis by activating Bak1 protein.
【Key words】 Apigenin；Glioma；Proliferation；Apoptosis；Bak1
恶性胶质瘤是严重威胁人类健康的颅内最常见的原发性肿瘤之一，易复发，难治愈，迄今没有满意的治疗方法，即使联合手术、放疗和化疗，其中位数生存期也只有诊断后12～14个月，而且在过去的几十年内进展不大[1-3]。芹菜素(apigenin) 是天然存在的一种黄酮类化合物，有多种药理活性，如降血压、镇静、抗菌以及雌激素样作用等[4-5]，近年来发现其对乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤也具有抑制作用[6-7]。但芹菜素对胶质瘤的作用国内外基础研究及临床应用仍然比较少。本实验研究主要探讨芹菜素抗胶质瘤的作用及其机制。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 人胶质瘤U87细胞购自中国科学院上海细胞研究所。芹菜素购自美国Sigma有限公司。高糖DMEM培养基和胎牛血清购自美国gibco公司。WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京碧云天生物科技公司。Bak1 抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。BAK1 siRNA购自EnoGene公司。
1．2 细胞培养和传染 U87细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，每隔1～2 d更换1次培养基，铺瓶率达到70%～80%时，胰酶消化传代。选择指数增长的细胞转染BAK1 siRNA，24 h后更换培养基，流式分析转染效率。
1．3 WST-1实验检测细胞增殖能力 细胞经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至每孔加入100 μL 2 000个细胞，种植于96孔板，24 h后，给予0、20、40 μmol/L芹菜素，每组设6个复孔，培养72 h，每孔加入10 μL WST-1溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，把96孔板置于摇床上摇动1 min，以充分混匀待检测体系，测定450 nm波长处的吸光度值。
1．4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 0、20、40 μmol/L芹菜素处理U87细胞48 h后，把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤1次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。吸除胰酶细胞消化液，加入收集的细胞培养液把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5万～10万重悬的细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入195 mL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中。最后用流式细胞仪检测。
1．5 Western Blot鉴定 40 μmol/L芹菜素处理U87细胞48 h后，用裂解液裂解细胞后提取总蛋白，加入5×上样缓冲液，煮沸后，在预制胶中加入10 μL样品，电泳1.5 h后，切胶转膜，300 mA 电流下4 ℃转膜90 min，37 ℃封闭1 h，Bak1抗体1：1 000稀释后37 ℃孵育1.5 h后，孵育二抗1.5 h。显影液显影，凝胶成像仪成像。
1．6 统计学方法 实验结果采用SPSS 19.0统计软件进行分析，数据采用单因素方差分析，P＜0.05提示差异有统计学意义。
2 结果
2．1 芹菜素抑制U87细胞增殖 如图1A，U87细胞用20、40 μmol/L芹菜素干预24 h后，细胞增殖能力明显下降，并随着药物浓度和时间的增加，细胞的生长抑制率也明显增加。而U87细胞采用Bak1 siRNA预处理后，芹菜素对U87细胞的抑制能力明显下降(图 1B)。
图1 A：20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的生长抑制率；B：Bak1 siRNA预转染U87细胞24 h后20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的生长抑制率
2．2 芹菜素诱导U87细胞凋亡 如图 2A，U87细胞用20、40 μmol/L芹菜素干预24 h后，U87细胞出现凋亡，并随着药物浓度和时间的增加，细胞凋亡率也明显增加。而U87细胞采用Bak1 siRNA预处理后，芹菜素诱导U87细胞的凋亡率也明显下降(图 2B)。
图2 A：20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的细胞凋亡率；B：Bak1 siRNA预转染U87细胞24 h后20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞干预72 h的细胞凋亡率
2．3 芹菜素抑制Bak1 蛋白表达 进一步我们利用20、40 μmol/L芹菜素处理U87细胞72 h后，Western Blot检测U87细胞Bak1蛋白的表达。我们研究表明芹菜素可明显抑制U87细胞中Bak1蛋白的表达，并且随着药物浓度的增加，抑制效应更加明显(图3)。
图3 20、40 μmol/L芹菜素对U87细胞Bak1蛋白的表达的影响 A：凝胶电泳图；B：直方图
3 讨论
芹菜素又称芹黄素，是天然存在的一种黄酮类化合物， 有植物雌激素之称， 广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中，其中芹菜中含量最高。目前已经作为药物和保健产品用来控制血压及软化血管的用途。芹菜素的化学名称是4'，5，7-三羟基黄酮，分子式为C15H10O6，分子量为270，不溶于水，易溶于乙醇、二甲基亚砜(DMSO)，具有多种药理活性，如抗菌、降血压、镇静等。但近年来研究发现其对肿瘤也具有一定的抑制作用[8-12]：如抵抗肿瘤的增殖和侵袭能力，抑制血管生成以及促使细胞凋亡等作用。
MAFUVADZE等[13-14]研究表明，芹菜素抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭及血管生成能力，并且促使部分肿瘤细胞发生凋亡。KUO等[15-17]研究表明，芹菜素可诱导胃癌细胞发生凋亡，及诱导凋亡的作用呈现药物浓度依赖性，且证实芹菜素诱导胃癌细胞凋亡的机制主要是通过bax/bcl-2-caspase-3、9的线粒体凋亡通路活化实现的。SHUKLA等[18-20]研究发现，芹菜素有效抑制前列腺癌细胞增殖，其发挥作用的机制是诱导前列腺癌细胞细胞周期阻滞于G2/M期，这种抑制作用同样表现出现药物浓度依赖。GAO等[21-23]研究发现，芹菜素能诱导Hep G2人肝癌细胞的分化，有效地降低γ-GT 的活性和AFP 的表达。LEE等[24-26]研究证实芹菜素可通过抑制P34Cdc2 激酶的活性从而抑制SW480、HT-29和Caco2三种结肠癌细胞增殖。
而芹菜素对胶质瘤的基础研及临床应用研究仍然比较少。国内仅杨志英等[27]研究报道芹菜素可通过诱导p21、p53 蛋白表达抑制U251 胶质瘤细胞生长。而国外期刊上，WANG等[28]研究发现，芹菜素可通过上调TNF-α水平，过表达Bid蛋白及下调Bcl-xL蛋白增强Hydroxygenkwanin抗胶质瘤作用。但FENG等[29-30]研究发现，芹菜素对U251胶质瘤干样细胞抗增殖作用效果不明显。本实验研究中我们发现芹菜素具有良好的抗胶质瘤效应，20、40 μmol/L芹菜素即可抑制胶质瘤细胞增殖，并促进部分胶质瘤细胞发生凋亡，实验表明胶质瘤细胞用芹菜素干预后Bak1蛋白表达明显上调，而抑制Bak1蛋白表达后，芹菜素的这种抗胶质瘤作用明显减弱，表明芹菜素抗胶质瘤作用主要依赖于调控Bak1蛋白表达。
4 参考文献
[1] HADZIAHMETOVIC M，SHIRAI K，CHAKRAVARTI A．Recent advancements in Multimodality treatment of gliomas[J]．Future Oncol，2015，7(10)：1 169-1 183.
[2] 王忠诚，主编．神经外科学[M]．武汉：湖北科学技术出版社，2005：398-452.
[3] STORSTEIN A，HELSETH E，JOHANNESEN T B，et al.High-grade gliomas in adults[J]．Tidsskr Nor Laegeforen，2011，131(3)：238-241.
[4] 黄佳颖，杨悦，李玉荣，等．芹菜素的研究进展[J]．江苏科技信息·生命科技，2015，2(4)：57-58.
[5] ARANGO D，DIOSA-TORO M，ROJAS-HERNANDEZ L S，et al.Dietary apigenin reduces LPS-induced expression of miR-155 restoring immune balance during inflammation[J]．Mol Nutr Food Res，2015，59(4)：763.
[6] 郭霜，张晚霞，余薇．芹菜素药理作用的研究进展[J]．湖北科技学院学报(医学版)，2016，3(30)：273-276.
[7] TANG A Q，CAO X C，TIAN L，et al.Apigenin inhibits the self-renewal capacity of human ovarian cancer SKOV3-de-rived sphere-forming cells[J]．Mol Med Rep，2015，11(3)：2 221.
[8] PATEL D, SHUKLA S, GUPTA S. Apigenin and cancer chemoprevention：progress, potential and promise (review)[J]．Int J Oncol，2007，30(1)：233-245.
[9] 吴华涛，马涛，崔勇．芹菜素对肿瘤抑制作用研究进展[J]．中国现代医生，2009，47(6)：41.
[10] HADZIAHMETOVIC M，SHIRAI K，CHAKRAVARTI A．Recent advancements in multimodality treatment of gliomas[J]．Future Oncol，2011，7(10)：1 169-1 183.
[11] SHUKLA S，GUPTA S．Apigenin：a promising molecule for cancer prevention[J]．Pharm Res，2010，27(6)：962-978.
[12] FREITAS S，COSTA S，AZEVEDO C，et al.Flavon-oids inhibit angiogenic cytokine production by human glioma cells[J]．Phytother Res，2011，25(6)：916-921.
[13] MAFUVADZE B，COOK M，XU Z，et al.Effects of dietary apigenin on tumor latency，incidence and multiplicity in a medroxyprogesterone acetate-accelerated 7，12-dimethylbenz(a)anthracene-induced breast cancer model[J]．Nutr Cancer，2013，65(8)：1 184-1 191.
[14] 张伟然，张斌，刘博文，等．芹菜素诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞系非P53依赖性凋亡的研究[J]．中国肿瘤临床，2013，12(3)：134-139.
[15] KUO C H，WENG B C，WU C C，et al.Apigenin has anti-atrophic gastritis and anti-gastric cancer progres-sion effects in Helicobacter pylori-infected Mongolian gerbils[J]．J Ethnopharmacol，2014，151(3)：1 031-1 039.
[16] 孙悦，余洋，吴坤．芹菜素诱导胃癌SGC-7901细胞自噬及其对凋亡的影响[J]．癌变·畸变·突变，2017，8(4)：289-294.
[17] MELSTROM L G，SALABAT M R，DING X Z，et al.Apigenin down-regulates the hypoxia response genes：HIF-1α，GLUT-1，and VEGF in human pancreatic cancer cells[J]．J Surg Res，2011，167(2)：173-181.
[18] SHUKLA S，FU P，GUPTA S．Apigenin induces apoptosis by targeting inhibitor of apoptosis proteins and Ku70-Bax interaction in prostate cancer[J]．Apoptosis，2014，19(5)：883-894.
[19] 李卫林，南存金，王怡君，等．芹菜素对人前列腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用[J]．中华实验外科杂志，2011，12(12)：2 049-2 051.
[20] SINGH V，SHARMA V，VERMA V，et al.Apigenin manipulates the ubiquitin-proteasome system to rescue estrogen receptor-β from degradation and induce apoptosis in prostate cancer cells[J]．Eur J Nutr，2015，54(8)：1 255.
[21] GAO A M，KE Z P，WANG J N，et al.Chen H．Apigenin se-nsitizes doxorubicin-resistant hepatocel-lular carcinoma BEL-7402/ADM cells to doxorubicin via inhibiting PI3K/Akt/Nrf2 pathway[J]．Carcinogenesis，2013，34(8)：1 806-1 814.
[22] 陈婷，王桂香，潘雪刁，等．芹菜素对人肝癌细胞Hepg2增殖与葡萄糖摄取的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2015，23(8)：234-239.
[23] HUANG C S，LII C K，LIN A H，et al.Protection by chry-sin，apigenin，and luteolin against oxidative stress is mediated by the Nrf2-dependent up-regulation of heme oxygenase 1and glutamate cysteine ligase in rat primary hepatocytes[J]．Arch Toxicol，2013，87(1)：167.
[24] LEE Y，SUNG B，KANG Y J，et al.Apigenin-induced apoptosis is enhanced by inhibition of autophagy formation in HCT116 human colon cancer cells[J]．Int J Oncol，2014，44(5)：1 599-1 606.
[25] 孟勇，李华，马清涵，等．芹菜素对结肠癌SW480细胞MMP及CD44v6作用的实验研究[J]．中华全科医学，2011，8(8)：1 165-1 178.
[26] LEFORT E C，BLAY J．The dietary flavonoid apigenin enhances the activities of the anti-metastatic protein CD26 on human coloncarcinoma cells[J]．Clin Exp Metastasis，2011，28(4)：337.
[27] 杨志英，邓志刚，伍健明，等．芹菜素对U251 胶质瘤细胞生长及p21、p53 蛋白表达的影响[J]．中国医药生物技术，2013，8(3)：192-195.
[28] GIANCETTI F G，TARONE G．Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signa-ling[J]．Ann Rev Cell Dev Biol，2003，19：173-206.
[29] GROSSMAN S A，BATARA J F．Current management of glioblastoma multiforme[J]．Semin Oncol，2004，31(5)：635-644.
[30] ZENG C，ZHANG X，LIN K，et al.Camptothecin Induces Apoptosis in Cancer Cells via MicroRNA-125b-Mediated Mitochondrial Pathways[J]．Mol Pharmacol，2012，81：578-586.
(收稿2017-07-13 修回2017-11-20)
本文编辑：张喜民
本文引用信息：贡伟一，程峰，刘华，张曙光．芹菜素对胶质瘤U87细胞的抗增殖作用及其机制研究[J]．中国实用神经疾病杂志，2018，21(1)：12-15.
