病毒性脑炎患儿细胞因子和免疫功能的临床研究

王跃生  张  敬  李小芹^△

郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院，河南 郑州 450003

基金项目：2014年度河南省医学科技攻关普通项目(编号：201403251)

作者简介：王跃生，Email：wangyuesheng@126.com

△通信作者：李小芹，Email：lixiaoqinys@126.com

【摘要】  目的  探讨病毒性脑炎患儿细胞因子和免疫功能的表达。方法  选择单纯肠道病毒感染患儿30例，合并病毒性脑炎患儿30例。检测第1、14天白介素－2(IL－2)、白介素－6(IL－6)、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)，CD3^＋T细胞，NK细胞相对活性及外周血CD4^＋/CD8^＋比值，分析其与疾病进展的相关性。结果  单纯肠道病毒感染组入院第1天血清IL－2、IL－6和TNF－α水平显著增加，同时CD3^＋T细胞，NK细胞相对活性及外周血CD4^＋/CD8^＋比值显著下降，与合并脑炎患儿相比更显著；治疗第14天单纯组血清IL－2、IL－6和TNF－α水平较第1天均显著降低，与合并脑炎患儿相比更显著(P＜0.05)；CD3^＋T细胞，NK细胞活性及外周血CD4^＋/CD8^＋比值明显升高，与合并脑炎患儿相比更显著(P＜0.05)。结论  免疫因素在病毒性脑炎发病机制中起着重要作用，肠道病毒感染导致炎症反应和免疫失衡。

【关键词】  肠道病毒感染；病毒性脑炎；儿童；炎症因子；细胞免疫

【中图分类号】  R512.3    【文献标识码】  A    【文章编号】  1673－5110(2018)21－2361－06  DOI：10.12083/SYSJ.2018.21.506

WANG Yuesheng，ZHANG Jing，LI Xiaoqin

Children’s Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Henan Children’s Hospital，Zhengzhou Children’s Hospital，Zhengzhou 450052，China

【Abstract】  Objective  To analyze inflammatory Cytokine and immune function in patients with viral encephalitis(VE)．Methods  60 children patients were divided into simple enterovirus infection group (30 cases) and VE group (30 cases)．Before treatment and 14 days after treatment，blood samples were collected for analysis of interleukin－2(IL－2)，interleukin－6 (IL－6)，tumor necrosis factor－α(TNF－α)，CD3 ^＋ T cells，NK－cells activity and peripheral blood CD4 ^＋ / CD8 ^＋ ratio.Results  The levels of IL－2，IL－6 and TNF－α were significantly increased in 2 groups，while the activity of NK cells and CD8^＋ / CD4^＋ ratio decreased significantly in the first groups.After treatment in the 14 days，compared with the first day of admission，the serum levels of IL－2，IL－6 and TNF－α in the two group were significantly decreased，Compare with VE group was a significant decrease.The VE group in patients with NK－cells activity and CD4^＋ / CD8^＋ ratio were significantly decreased (P＜0.05)．Conclusion  There are serious disorders in immune function in patients with viral encephalitis，and enterovirus infection leads to inflammatory response and immune imbalance.

【Key words】  Enterovirus；viral encephalitis；Children；Inflammatory cytokine；Immune function

        病毒性脑炎(viral encephalitis，VE)是儿童最多见的中枢神经系统感染性疾病之一。各种病毒均可引起的急性颅内炎症，主要临床表现为发热、颅内压增高、部分神经功能缺损、意识不同程度障碍、癫痫及惊厥发作，其病情轻重差异较大^[1－2]。病毒感染机体后，多种免疫细胞应答活化，激活的淋巴免疫细胞经损伤的血脑屏障侵入中枢神经系统，神经元和神经胶质细胞受到感染后与淋巴细胞共同释放大量细胞因子，从而介导中枢神经系统发生炎症反应^[3]，早期发现合理诊治尤为重要^[4]。本研究主要分析病毒性脑炎患儿体内细胞因子水平、细胞免疫功能状态，从而揭示肠道病毒感染后对机体的影响。

1．1  研究对象  选择2014－05—2017－05在郑州儿童医院消化科住院患儿60例，入选标准：①年龄：1～5岁；②入选患儿病史及辅助检查均诊断为病毒性脑炎^[5]，且发病在急性期(发病8d以内)临床表现为发热、头痛、呕吐、精神差、抽搐等症状。③确诊病毒性腹泻病例：在腹泻粪便标本中检测出轮状病毒、杯状病毒、星状病毒、肠道腺病毒。④排除严重心肺疾患，或有严重的脑外伤，或有严重免疫缺陷及既往有脑损伤病史或神经系统肿瘤。分为单纯肠道病毒感染患儿30例、合并病毒性脑炎患儿30例。男39例，女21例，平均年龄(4.1±1.2)岁；比较2组患儿在入院病情严重程度、年龄、性别方面，差异无显著统计学意义(P＞0.05)。

1．2.1  测定指标：测定2组患儿第1、14天外周血IL－2、IL－6、TNF－α水平，流式细胞仪检测CD3^＋ T细胞，CD4^＋T细胞，CD8^＋T细胞，NK细胞相对活性，外周血CD4^＋/CD8^＋比值。

1．2.2  测定细胞因子：清晨空腹采集患儿治疗第1、14天静脉血2 mL，离心机分离血清后，使用ELISA方法，进行IL－2、IL－6以及TNF－α定量检测。检测步骤按照试剂盒说明书程序操作，试剂盒均购自博士德生物科技有限公司。

1．2.3  流式细胞术检测T淋巴细胞亚群：2组患儿于治疗第1、14天清晨空腹时采集2 mL静脉血标本，肝素钠抗凝处理，分别取100 μL加入适当比例相应抗体混匀。避光孵育半小时后加入红细胞裂解液，半小时反应后立即检测，采用FACS Calibur型流式细胞仪(BD公司，美国)对全血标本中CD3＋T细胞，CD4＋T细胞，CD8＋T细胞以及NK细胞进行检测，并测定CD3＋T淋巴细胞计数，NK细胞相对活性，外周血CD4＋/CD8＋细胞比值。

1．2.4  病毒性腹泻检测：腹泻患儿入院24 h内收集标本，或腹泻3 d内的粪便。标本采集后立即予－20 ℃冰箱保存。所有标本由国家疾控中心病毒所腹泻室进行统一检测，检测内容包括HRV、HuCV、EAdV、HAstV抗原检测。HRV使用酶联免疫试剂盒进行抗原检测，HuCV、EAdV、HAstV直接使用PCR的方法进行检测。

1．3  统计学处理  数据用SPSS 13.0统计软件分析，计数资料采用χ²检验，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间差异采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2．1  2组患儿血清炎症因子的表达  2组患儿发病初期体内细胞因子水平均明显升高。与治疗第1天相比，第14天所有患儿血清IL－2、IL－6及TNF－α均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；第14天单纯病毒感染组较合并病毒性脑炎患儿IL－2、IL－6及TNF－α水平降低更明显，差异有统计学意义(P＜0.01，表1)。

2．2  2组细胞免疫功能的表达  2组患儿发病初期细胞免疫表达均下调。与治疗第1天相比，第14天2组CD3^＋T细胞、NK细胞相对活性及外周血CD4^＋/CD8^＋比值较治疗前显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；第14天单纯病毒感染组较合并病毒性脑炎组CD3^＋ T细胞、NK细胞相对活性及外周血CD4^＋/CD8^＋比值显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表1  2组血清炎症因子的表达  (x±s)

Table 1  Expression of serum inflammatory factors in 2 groups  (x±s)

时间	合并病毒性脑炎(n＝30)	单纯肠道病毒感染组(n＝30)	t值	P值
IL－2(ng/L)
第1天	19.85±3.13	15.81±2.17	0.867	＞0.05
第14天	12.10±2.93	7.25±1.83	7.271	＜0.01
IL－6(ng/L)
第1天	8.62±3.30	6.51±2.63	0.82	＞0.05
第14天	6.02±2.21	2.56±0.94	5.19	＜0.01
TNF－α(ng/L)
第1天	17.95±4.13	15.51±2.63	0.387	＞0.05
第14天	11.52±3.61	4.76±2.34	5.362	＜0.01

表2  2组细胞免疫的表达  (x±s)

Table 2  Expression of cellular immunity in 2 groups  (x±s)

时间	合并病毒性脑炎(n＝30)	单纯肠道病毒感染组(n＝30)	t值	P值
CD3＋
第1天	41.85±4.27	52.97±3.23	3.497	＜0.05
第14天	48.21±5.32	66.32±4.18	7.171	＜0.01
NK细胞相对活性(%)
第1天	0.12±0.04	0.09±0.05	1.613	＞0.05
第14天	0.18±0.05	0.35±0.02	4.891	＜0.05
CD4＋/CD8＋
第1天	0.97±0.23	0.85±0.27	0.497	＞0.05
第14天	1.32±0.18	2.21±0.32	5.171	＜0.01

        儿童病毒性腹泻病病原主要为：轮状病毒、人类星状病毒、人杯状病毒、肠道腺病毒^[6、7]。肠道病毒感染患儿早期产生的大量IL－2、IL－6、TNF－α等促炎细胞因子破坏毛细血管内皮，导致组织损伤^[8]，微血管循环障碍及微血管壁通透性增加，诱发全身组织炎症反应。研究发现，炎症因子在病毒性脑炎患儿多个病程阶段进行调节^[9]。Th1细胞活化后产生IL－2，IL－2刺激巨噬细胞分化、促进NK细胞增殖及CTL细胞成熟分化，介导细胞免疫发生；增加IL－2R在T细胞表面的表达，刺激其他细胞因子的分泌。正常功能的IL－2能增强免疫系统的活性，调节感染的免疫应答及免疫病理的过程，从而抑制病毒感染及其它相关病理变化。但是，若IL－2的产生或表达异常可导致疾病的发生。IL－6因子介导B细胞产生抗体，促进B细胞分化，活化T细胞增殖，促进T细胞分化为CTL细胞；可降低TNF－α活性和诱导急性期蛋白的产生，起到抗炎作用，增强T细胞的免疫及细胞功能，促进B细胞分泌表达特异性抗体^[10]，抗体清除抗原，降低炎症反应，对中枢神经系统抗损伤防御起到重要作用^[11－12]。IL－6亦可诱导机体免疫细胞抗病毒，与巨噬－粒细胞集落刺激因子共同作用使免疫细胞增殖分化，诱导T细胞的祖细胞生成CTL细胞，进一步介导组织免疫损伤；IL－6作为内源性致热源参与炎症反应，使炎症反应增强并持续。既往研究发现，IL－2、IL－6参与机体局部的免疫应答反应，其介导免疫失衡过程中具有关键的作用^[13－14]。TNF－α是一种促炎细胞因子，由单核－巨噬细胞分泌合成，具有多重生物学行为，主要来源于中枢神经系统的星形胶质细胞和小胶质细胞，当中枢神经系统感染时，病原体透过血脑屏障侵犯脑组织时，病毒直接刺激和炎性因子的作用下导致TNF－α高水平表达^[15－16]，病菌感染时介导炎症传递，引起宿主组织细胞严重的发热、休克等病理损害，进而促进炎症反应的进展。脑组织在病毒直接刺激和炎性因子的作用下，对脑组织细胞的抑制或杀伤越明显^[17－18]。

        研究揭示炎症因子的检测有助于病毒性脑炎的诊断^[19－20]，合并癫痫患儿炎症反应更明显^[21]。本研究2组患儿发病早期IL－2、IL－6、TNF－α水平均明显增高，肠道病毒合并病毒性脑炎患儿细胞因子水平明显高于单纯肠道病毒感染患儿，表明病毒性脑炎患儿体内存在炎症过度反应；经治疗后上述指标明显下降，但合并脑炎患儿细胞因子水平在第14天仍高于单纯肠道病毒感染组。推测病毒性脑炎患儿脑组织细胞损伤后刺激炎性因子，激活细胞因子级联反应，从而加重脑炎患儿病情。因此，细胞因子变化可以预测病毒性脑炎患儿严重程度。

        机体免疫系统主要由细胞免疫、体液免疫及固有免疫构成。其中T淋巴细胞是清除病毒感染重要的免疫细胞，体内的细胞免疫功能所处的状态由它的数量及功能反映。目前主要由流式细胞仪测定T细胞亚群，是判定细胞免疫功能高低的主要方法之一。NK细胞作为固有免疫的关键细胞，是机体抵抗外来病毒感染的首要屏障，可直接识别并杀伤病毒感染，还可分泌IFN、TNF等细胞因子干扰病毒复制，吞噬细胞活化增殖，提高机体抵抗病毒感染的防御能力，在阻止肠道病毒感染机体的过程中起到重要作用。机体感染肠道病毒后，激活免疫细胞，免疫系统活化并启动应答^[22]，病毒感染神经系统时破坏血脑屏障功能，侵入中枢神经系统的活化T淋巴细胞与神经组织细胞共同释放大量IL－2、IL－6、TNF－α炎性因子，从而介导脑组织产生炎症损伤^[23－24]。 因此，病毒感染直接导致机体免疫功能损伤、紊乱，激活T淋巴细胞介导中枢神经系统炎症免疫损伤^[25]。根据T淋巴细胞在免疫应答中不同作用分为多个亚群，可激活巨噬细胞增殖、促进B淋巴细胞和自然杀伤细胞及CD8^＋淋巴细胞分化成熟，产生分化因子和生长因子^[26]。机体正常的 免疫应答由CD4^＋、CD8^＋细胞数量、NK细胞的活性，及不同细胞亚群间相互信息的传递所决定^[27]。CD4^＋、CD8^＋T细胞相互制约产生适度的免疫应答，既能清除病原体又不损伤自身组织，处于动态平衡的状态，机体免疫抑制时CD4^＋/CD8^＋比值的降低，当比值的升高时可上调机体细胞免疫功能，机体免疫功能的稳定有赖于其比值动态平衡。NK细胞是机体重要的抗感染及抗肿瘤免疫防御细胞，NK细胞活性增加及功能恢复利于机体清除感染，保护组织脏器功能，病毒性脑炎患儿NK细胞明显受损^[28]，NK细胞功能减低或者功能缺陷会发生严重的肠道病毒的感染，机体发生细胞免疫紊乱，产生过量的细胞因子，扩大炎症反应范围，侵犯中枢神经系统时，血管内皮细胞损伤，血管通透性增加，继发产生多种神经毒物质，直接或间接加重脑组织水肿^[29]，轻重症病毒性脑炎均存在细胞免疫紊乱，临床症状与细胞紊乱呈正相关，与临床预后正相关。同时，病毒性脑炎患儿伴随免疫力低下，临床发展结局与机体免疫功能密切相关^[30]。因此，CD3^＋T细胞的表达，外周血CD4^＋/CD8^＋比值的平衡及NK细胞相对活性可反映机体的免疫功能状态。

        CD3^＋T细胞测定反映总T细胞计数，机体总体细胞免疫功能状态。CD4^＋T细胞主要为辅助性Th细胞，在机体的免疫应答过程中受到抗原刺激后，由不同的细胞因子介导分化成的不同亚群，包括Th1、Th2、Thl7细胞和调节性T淋巴细胞(Treg)，Th1在机体细胞免疫应答与迟发性超敏反应起主导作用，并刺激B细胞产生免疫球蛋白。而Th2可分泌IL－4、IL－5、IL－9等细胞因子，参与体内体液免疫应答，协同B细胞生成特异性IgE，发挥机体非吞噬功能的防御反应。人体的正常免疫功能有赖于Thl与Th2间动态平衡^[31－36]。CD8^＋T细胞活化后可参与病毒的清除过程，是清除病毒的重要效应细胞。同时，机体细胞免疫系统的应答调节与病毒性脑炎患儿预后有显著相关性^[37－40]。本研究2组患儿发病初CD3^＋T细胞、 NK细胞相对活性、CD4^＋/CD8^＋比值均低于正常值，提示肠道病毒感染患儿机体处于免疫抑制状态，细胞免疫功能的低下与紊乱。治疗后较前升高，但肠道病毒感染合并脑炎患儿NK细胞相对活性、CD4^＋/CD8^＋比值显著低于单纯肠道病毒感染者，推测可能与肠道病毒感染合并病毒性脑炎患儿机体下调细胞免疫功能有关^[41－42]，且感染程度严重的细胞免疫抑制更明显，病毒进入脑脊液加速神经细胞损伤，从而揭示病情严重程度与免疫功能存在负相关，调节免疫利于病毒性脑炎的恢复^[43－47]。

        肠道病毒感染患儿存在免疫功能紊乱、细胞因子激活状态，且与病情严重程度存在相关性，患儿临床症状越重，细胞紊乱越严重，患儿预后也越差。早期全面了解机体免疫功能，为病毒感染治疗提供了重要线索，从而降低并发症的发生率。

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(收稿2018－03－07  修回2018－08－15 )

本文责编：关慧

本文引用信息：王跃生，张敬，李小芹．病毒性脑炎患儿细胞因子和免疫功能的临床研究[J]．中国实用神经疾病杂志，2018，21(21)：2361－2366.DOI：10.12083/SYSJ.2018.21.506

Reference information：WANG Yuesheng，ZHANG Jing，LI Xiaoqin.Study on inflammatory cytokine and immune function in patients with viral encephalitis[J]．Chinese Journal of Practical Nervous Diseases，2018，21(21)：2361－2366.DOI：10.12083/SYSJ.2018.21.506