大鼠脑创伤模型中Leptin蛋白表达的时间依从性变化

张  婷¹⁾  宋  宇^2)△  魏志玄³⁾

1)南阳医学高等专科学校基础医学部病理教研室，河南 南阳 473061  2)南阳医学高等专科学校第三附属医院神经外科，河南 南阳 473000  3)南阳医学高等专科学校第一附属医院神经外科，河南 南阳 473000

基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划项目，编号：122300410330  

△通信作者：宋宇(1969—)，男，主任医师，教授。研究方向：脑损伤及脑保护。Email：syulxj@163.com

【摘要】  目的  研究创伤性脑损伤大鼠模型的脑组织中，Leptin蛋白表达的时间依从性变化，并探讨其与炎症细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)之间的关系。方法  选用健康成年雄性SD大鼠，采用自由落体打击法制作大鼠脑挫裂伤模型，应用随机数字表进行完全随机化分组，把大鼠分为对照组、中型脑损伤组、重型脑损伤组。于模型制作成功后第1、3、5 天处死大鼠，制备脑组织匀浆，采用ELSISA的方法对标本细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)及Leptin蛋白均进行检测。结果  中型脑损伤组，脑损伤后第1天，脑组织中的IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin的浓度与对照组相比显著增高(P＜0.05)，第3、5天回归至对照组水平，IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin之间明显相关。重型脑损伤组，脑损伤后第1天，脑组织中的IL-6、IL-1β、TNF-α的浓度明显增高(P＜0.05)，第3天、5天回归至对照组水平，而Leptin在脑损伤后第1天明显降低，第5天升至对照组水平，和IL-6、IL-1β、TNF-α之间无显著相关。结论  Leptin的表达水平与脑损伤的程度有关，在重型脑损伤的炎症反应早期Leptin蛋白的释放受到抑制。

【关键词】  创伤性脑损伤；炎症因子；Leptin蛋白；时间依从性；大鼠

【中图分类号】  R-332    【文献标识码】  A    【文章编号】  1673-5110(2018)04-0349-04  DOI：10.12083/SYSJ.2018.04.089

ZHANG Ting¹⁾，SONG Yu²⁾，WEI Zhixuan³⁾

1)Department of Pathology，Basic Medicine Department of NanYang Medical College，Nanyang 473061，China；2) Department of Neurosurgery，Third Affiliated Hospital of NanYang Medical College，Nanyang473000，China；3) Department of Neurology，First Affiliated Hospital of NanYang Medical College，Nanyang 473000，China

【Abstract】  Objective  To investigate time-dependentchanges in Leptin concentrations in brain tissue followingexperimental traumatic brain injury and to examine the relationshipwith cytokines such as IL-6，IL-1β，TNF-α.Methods  The model of SD rat brain contusion was established byfree fall striking method，and the random digital table was used to randomize the group.Rats weredivided into 3 groups based on thedepth of deformation：sham controls，moderate injury and severe injury.Animalswere sacrificed on the 1st，3rd and 5th days post-injury.The expression of IL-1β，IL-6，TNF-αand Leptin in different time was observed by enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA)．Results  One day after moderate injury，IL-1β，IL-6，TNF-αand Leptin levelswere found to be markedly increased in the brain tissue.On the 3rd and 5th days，the levels decreased to the shamcontrollevels.Following severe injury，IL-1β，IL-6 andTNF-α levels increased in correlation after the 1st day andreached the sham-control levels on the same days.However，Leptin tissue levels decreased on the 1st and 3rd daysand normalized to the sham-control levels on the 5th day.Conclusion  Leptin is decreasedin the early stage of severe injury.Leptin level correlates with degree of severetraumatic brain injury.

【Key words】  Traumatic brain injury；Inflammatory factor；Leptin；Time dependent；Rat

      创伤性脑损伤能够造成IL-6、IL-1β、TNF-α等因子的持续产生和释放，使这些炎症因子在细胞外和脑脊液中的浓度增加。这些细胞因子是中枢神经系统免疫反应的重要调节因素，在神经保护和神经损伤方面均起重要作用。Leptin蛋白通过OB基因编码16 KD的非糖基化蛋白分子，是由167个氨基酸组成的短肽，由脂肪组织产生并分泌进入循环系统，与下丘脑发生联系，能够调节能量的储存和饱胀感，从而影响体质量、代谢率和体温，Leptin蛋白在下丘脑-垂体-脂肪轴中起重要的作用。最近的研究表明^[1-5]，Leptin蛋白可能参与应激反应，促炎症细胞因子能够诱导其表达。本文研究Leptin蛋白在创伤性脑损伤大鼠模型脑组织中的时间依从性变化，并探讨其与炎症细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)之间的关系。

1．1  实验动物及分组  健康成年雄性SD大鼠33只(湖北省实验动物中心提供)，体质量250～300 g，应用随机数字表将大鼠进行完全随机化分组，分为对照组(假手术组)3只，中型脑损伤组15只，重型脑损伤组15只。

1．2  大鼠脑挫裂伤模型制作方法  以氯胺酮按照60 mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠后，大鼠脑立体定位仪固定大鼠头部，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，正中切开顶部头皮，剥离骨膜显露左顶骨，于中线左侧旁开约3 mm，前囱后约2 mm处用开一直径5 mm圆形骨窗，保持硬膜完整。采用自由落体打击装置，以40 g砝码于20 cm高处通过金属导杆落下，撞击置于硬脑膜上的圆锥上致脑挫裂伤，通过调节圆锥尖端的长度调节脑挫伤的程度(中型1.5 mm，重型2.7 mm)，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。

1．3  标本制备  分别于模型制作成功后第1、3、5天迅速断头处死小鼠，制备脑组织匀浆，取挫伤的大脑组织(去除小脑和延髓部分)，称重后移入玻璃匀浆管中，加入9倍体积的预冷生理盐水，4 ℃条件下充分研碎匀浆，制备10%匀浆，离心机4 000 rpm离心10 min，取上清液，-80 ℃冻储存。

1．4  检测方法  所有标本细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)及Leptin蛋白均采用酶联免疫吸附剂测定分析方法ELISA的方法进行检测，用抗大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin单抗分别包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin与单抗结合，加入生物素化的抗人IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液，在450 nm处测OD值，IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin浓度。

1．5  统计学分析  运用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料进行数据的分布描述，计量资料的比较采用Mann-Whitney检验，2组或3组之间的数值比较采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

      在模型制作过程中，2只大鼠死亡并被替换，中型脑损伤组，脑损伤后第1天，脑组织中的IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin的浓度与对照组相比显著增高(P＜0.05)，第3天，第5天回归至对照组水平，IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin之间明显相关(见表1，图1)。重型脑损伤组，脑损伤后第1天，脑组织中的IL-6、IL-1β、TNF-α的浓度与对照组相比显著增高(P＜0.05)，与中型组相似，第3天、第5天回归至对照组水平，而Leptin在脑损伤后与对照组相比第1天显著降低，第5天升至对照组水平，IL-6、IL-1β、TNF-α和Leptin之间无明显相关(见表2，图2)。

表1  中型脑损伤组各因子在伤后1、3、5 d脑组织中的浓度  (x±s，pg/g)

组别	IL-1β	IL-6	TNF-α	Leptin
对照组	234.42±10.13	806.96±81.21	813.32±9.36	1 503.32±41.93
中型脑损伤组
伤后第1天	338.28±17.52	1 138.21±95.64	1 238.56±74.44	2 343.41±269.62
伤后第3天	289.24±4.21	864.79±40.62	931.19±33.81	1 531.84±123.54
伤后第5天	216.94±24.74	728.27±49.71	851.02±35.83	1 567.43±35.85

表2  重型脑损伤组各因子在伤后1、3、5 d脑组织中的浓度  (x±s，pg/g) 

组别	IL-1β	IL-6	TNF-α	Leptin
对照组	234.42±10.13	806.96±81.21	813.32±9.36	1 503.32±41.93
重型脑损伤组
伤后第1天	383.62±12.23	1 330.32±36.54	1 410.23±101.38	954.18±129.62
伤后第3天	277.33±10.64	879.15±99.62	911.73±69.57	754.42±50.03
伤后第5天	226.72±17.72	738.37±45.91	735.19±81.83	1 339.84±81.51

图1  中型脑损伤组IL-1β，IL-6，TNF-α和Leptin在伤后1、3、5 d的关系  图2  重型脑损伤组IL-1β，IL-6，TNF-α和Leptin在伤后1、3、5 d的关系

 

      创伤性脑损伤能够导致中枢神经产生炎症反应，当脑外伤发生后，血脑屏障发生破坏，导致来自循环系统的大量白细胞聚集于中枢神经系统，这样就使促使炎症细胞激活并释放大量的促炎症因子，而这些因子(如IL-6、IL-1、TNF-α)有许多相似的生物活性，是许多重要炎症反应的介导因素。Leptin与一些细胞因子有相似的结构，可能起到与炎症因子相似的作用，因此，它被作为classⅠ细胞因子受体家族的一员，促炎症因子(IL-1β、TNF-α)是Leptin的重要调节因子^[6-8]。Leptin有脂肪组织合成分泌，不但参与炎症反应的调节，而且具有减肥作用，其依靠参与下丘脑的调节轴，能够降低食欲，增加热量的消耗，而且对生殖、造血、血管再生、胃肠功能调节、交感神经调节、骨骼发育、大脑发育等均有一定作用，有研究表明^[9-12]，Leptin有促进细胞增殖的作用。

      我们的研究表明，中度脑外伤组的大鼠，其Leptin的表达水平增加与脑组织中的IL-6、IL-1、TNF-α的浓度有关，而重型脑外伤组，在伤后1～3 d 与IL-6、IL-1、TNF-α的浓度呈负相关，这意味着在重型脑损伤炎症反应的早期Leptin蛋白的释放受到抑制，而且当其他促炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)增加时，其表达水平下降。有报道^[13-16]指出，在下丘脑-垂体轴未发育成熟的早产儿和下丘脑功能障碍的儿童中，Leptin蛋白的表达水平很低。RIGAUX等^[7]发现，Leptin蛋白和异位骨骼形成均与严重脑损伤导致的下丘脑损伤有关。下丘脑损伤可能破坏了Leptin蛋白的抗成骨作用，从而导致异位骨骼的形成，本次研究中中型脑损伤组Leptin早期升高，可能是因为损伤后早期机体处于高代谢、低能储状态，游离脂肪酸产生增多，通过神经内分泌系统反馈调节升高Leptin水平；重型损伤组所出现的Leptin蛋白在早期的抑制，与重型颅脑损伤造成下丘脑的损伤有关。许多研究^[17-22]表明，Leptin蛋白在炎症反应和免疫调节过程中起重要作用，在感染和炎症反应的情况下，Leptin蛋白水平增加，增强机体对炎症反应的耐受能力。SHI等^[9]的研究表明，在严重创伤发生后的早期，血浆中的Leptin蛋白水平下降，而其他细胞因子的表达增加(如IL-6、IL-1、TNF-α)，这意味着Leptin蛋白与这些因子在炎症反应中起相反的作用，可能通过这种作用起到保护和修复的作用。在败血症、感染性休克等情况下^[23-25]，血浆中的Leptin蛋白水平却明显增高，在慢性感染(如肺结核)和继发性感染中的情况下，Leptin蛋白水平却无明显改变，这种调节Leptin蛋白的机制和其在不同疾病中的作用，目前尚未完全清楚。

      我们的研究表明，Leptin的表达水平与脑损伤的程度有关，在重型脑损伤的炎症反应早期Leptin蛋白的释放受到抑制，而且当其他促炎症因子(IL-6、IL-1、TNF-α)增加时，其表达水平下降。这意味着Leptin参与了脑损伤后炎性反应，而且可能发挥一定程度的抗炎和修复细胞因子的作用。若能进一步证实Leptin的诊治价值，对于在颅脑损伤救治疗将具有十分重要的意义。

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(收稿2017-02-23  修回2017-12-18)

本文编辑：王喜梅